本文選題：異種移植　切入點(diǎn)：ZFN　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：(1)GGTA1敲除豬的研究面臨器官移植供體短缺的現(xiàn)狀,異種移植是一種可行的替代方案。大量研究證明豬是合適的異種移植供體。使用豬進(jìn)行異種移植仍然需要克服許多免疫排斥障礙,包括超急性免疫排斥反應(yīng)(HAR),急性體液異種排斥反應(yīng)(AHXR),急性細(xì)胞排斥反應(yīng)(ACR),凝血功能異常,慢性排斥反應(yīng)(CR)和炎癥反應(yīng)等。基于相關(guān)致病機(jī)理的研究,研究人員認(rèn)為制備基因修飾豬是克服異種移植免疫排斥障礙的有效措施。目前功能正常的豬多能干細(xì)胞系仍然沒(méi)有建立,而基于同源重組進(jìn)行的基因修飾在豬體細(xì)胞中效率較低,嚴(yán)重制約了相關(guān)研究的進(jìn)展。最近幾年出現(xiàn)了多種高效的基因定點(diǎn)修飾工具,包括鋅指核酶(ZFN),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)以及CRISPR/Cas9。這些技術(shù)被成功地應(yīng)用于各種模式生物中,我們也建立了基于ZFN和TALEN的豬基因修飾系統(tǒng)。我們首先使用ZFN制備GGTA1KO(GTKO)豬,然后在GTKO豬細(xì)胞中使用TALEN對(duì)豬白細(xì)胞抗原(SLAs)相關(guān)基因進(jìn)行修飾。GGTA1參與形成的Ga1是引起HAR的主要異種抗原。在進(jìn)化過(guò)程中,GGTA1在人類和舊世界猴中失去功能,導(dǎo)致他們的細(xì)胞表面沒(méi)有Ga1抗原,所以他們血液中存在大量靶向Ga1抗原的天然抗體。為了克服HAR障礙,研究人員在豬體細(xì)胞上通過(guò)同源重組修飾GGTA1并結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)制備GTKO豬,通過(guò)異種移植實(shí)驗(yàn)表明GTKO豬可以顯著抑制HAR的發(fā)生。但是這種技術(shù)不僅效率很低,而且會(huì)引入外源的抗藥基因,無(wú)法滿足后續(xù)大量基因修飾的需求。我們將靶向GGTA1編碼區(qū)序列的ZFN質(zhì)粒和抗藥質(zhì)粒通過(guò)瞬轉(zhuǎn)手段導(dǎo)入胎豬成纖維細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)藥物篩選獲得了18個(gè)單拷貝敲除和4個(gè)雙拷貝敲除的細(xì)胞克隆,效率分別為23.4%和5.2%。隨后我們將獲得的雙拷貝敲除的細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植,產(chǎn)生克隆豬。經(jīng)鑒定,一共獲得3頭GTKO豬。同時(shí)我們利用克隆胎兒建立了一個(gè)GTKO胎豬成纖維細(xì)胞系。通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定證明GTKO豬的細(xì)胞膜上Ga1抗原被完全清除。通過(guò)殺傷實(shí)驗(yàn)證明GTKO豬的細(xì)胞可以在與人血清共培養(yǎng)時(shí)不受抗體補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫攻擊。在GTKO豬的基礎(chǔ)上,我們通過(guò)TALEN技術(shù)修飾豬的SLAs,將其中的部分基因替換為人類白細(xì)胞抗原(HLAs)中的部分基因。我們?cè)O(shè)計(jì)并驗(yàn)證了靶向SLA-1和-2的TALEN。同時(shí)我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了相關(guān)的KI載體進(jìn)行基因替換實(shí)驗(yàn)。通過(guò)PCR驗(yàn)證HLA-A基因成功替代SLA-1,并能在豬細(xì)胞中表達(dá)。這一策略在異種移植中的效果仍需要使用實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行進(jìn)一步的異種移植驗(yàn)證。(2)低免疫原性人多能干細(xì)胞的研究人多能干細(xì)胞(hPSCs)具有自我更新能力,并可以在一定條件下分化為機(jī)體內(nèi)所有的細(xì)胞類型。所以研究人員嘗試將hPSCs分化為各種組織細(xì)胞,用于移植替換病人身上受損的組織細(xì)胞。在人類同種異體組織器官移植的過(guò)程中,供受體細(xì)胞表面的HLAs不兼容會(huì)導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。HLAs分為HLA Ⅰ和HLA Ⅱ:CD8+T細(xì)胞識(shí)別HLA Ⅰ,參與直接靶細(xì)胞殺傷作用;CD4+T細(xì)胞識(shí)別HLA Ⅱ,分泌大量細(xì)胞因子參與調(diào)控免疫反應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)室的工作重點(diǎn)在于使用定點(diǎn)基因修飾的方法降低hPSCs的免疫原性,以滿足其臨床使用的要求。我們實(shí)驗(yàn)室之前通過(guò)對(duì)B2M的KO已經(jīng)建立了 HLA Ⅰ缺陷的hPSCs,證明了其免疫原性的降低,同時(shí)hPSCs的多能性和自我更新能力都沒(méi)有顯著的變化。在本研究中我們使用TALEN對(duì)HLA Ⅱ的關(guān)鍵調(diào)控基因CIITA進(jìn)行KO,從而降低hPSCs及其分化獲得的細(xì)胞中的HLA Ⅱ相關(guān)基因的表達(dá)。CIITA-/-hPSCs在自我更新和分化能力方面與WT hPSCs無(wú)明顯差異。將CIITA-/-hPSCs分化為樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)后,CD83和CD86等表面蛋白標(biāo)記物正常表達(dá),但其結(jié)構(gòu)型HLA Ⅱ表達(dá)顯著下降。將CIITA-/-hPSCs分化為成纖維細(xì)胞后,在IFN-γ的刺激下誘導(dǎo)型HLA Ⅱ表達(dá)顯著下降。將分化獲得的CIITA--成纖維細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),CD4+T的活化減弱。這些結(jié)果說(shuō)明CIITA-/-hPSCs分化獲得的組織細(xì)胞可能降低CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。我們的研究將有利于推動(dòng)hPSCs的臨床應(yīng)用,尤其是將hPSCs分化為結(jié)構(gòu)型高表達(dá)HLAII的組織細(xì)胞進(jìn)行移植替換,比如DCs和T細(xì)胞等。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392.4
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本文編號(hào)：1571906