本文選題：淡色庫蚊　切入點：溴氰菊酯　出處：《南京醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：蚊是重要的醫(yī)學昆蟲,能傳播多種疾病,如瘧疾、登革熱、西尼羅河熱、絲蟲病、黃熱病等。由于方便、高效和經(jīng)濟等特點,采用殺蟲劑化學防制一直是蚊媒綜合治理策略中的主要方法。然而,殺蟲劑長期、大量地使用導致了蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展�？顾幮砸呀�(jīng)成為蚊媒病防制工作中的最大障礙。對蚊抗藥性相關(guān)基因的研究,最早采用功能克隆法(functional cloning strategy),主要是通過尋找殺蟲劑的靶標位點或代謝相關(guān)的解毒酶類,隨后再根據(jù)這些已知功能的蛋白質(zhì)或酶類來克隆其相應編碼基因。這種方法在單基因遺傳性狀研究中具有不可比擬的優(yōu)勢。其后,許多研究人員使用抑制性差減雜交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)、基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)等方法,鑒定了一些其它蚊抗藥性相關(guān)基因。然而,抗藥性是多個基因、多重機制參與的復雜生物進化現(xiàn)象,沒有某一個或一類已知基因能夠完整闡明抗藥性機制。全面系統(tǒng)尋找蚊抗藥性相關(guān)基因并探尋其參與抗藥性機制是蚊媒防制環(huán)節(jié)中亟待解決的問題。近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的出現(xiàn)使大規(guī)模篩選抗藥性相關(guān)基因、從整體層面研究蚊抗藥性成為可能。本課題以淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)實驗室種群溴氰菊酯敏感(Laboratory Deltamethrin-Susceptible,Lab-DS)品系和抗性(Laboratory Deltamethrin-Resistant,Lab-DR)品系為實驗材料。通過Illumina-Solexa高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),比較了2個品系預混樣本的基因表達情況。本次測序共檢測到4961197620對堿基和55124418條reads,匹配到Vectorbase致倦庫蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)數(shù)據(jù)庫后,組裝成17679個已知基因。按照差異倍數(shù)大于2倍(|log2Ratio|≥1),且假陽性率(False Discovery Rate,FDR)小于0.001的標準,我們共篩選到1826個差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),其中1078個基因在Lab-DR品系中高表達,748個基因在Lab-DR品系中低表達。這些DEGs包括細胞色素P450單加氧酶(p450s),表皮蛋白(cuticleproteins)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(udp-glucuronosyltransferases)、脂肪酶(lipases)、熱休克蛋白(heatshockproteins)、酯酶(esterases)、絲氨酸蛋白酶(serineproteases)、肽酶(peptidases)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(atp-bindingcassettetransporters)等。隨后,對這些degs進行了go(geneontology)功能和kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)通路顯著性富集分析。結(jié)果提示,在degs中顯著富集的go和kegg類別分別是代謝過程(metabolicprocess)和代謝通路(metabolicpathway)。同時,參照vectorbase致倦庫蚊數(shù)據(jù)庫,我們在lab-ds和lab-dr品系中分別優(yōu)化了8315和8511個vectorbase致倦庫蚊基因序列,并分別預測了4957和5048個新轉(zhuǎn)錄本(noveltranscriptunits,ntus)。為了證實rna-seq結(jié)果的可靠性,我們一方面采用實時熒光定量pcr(realtimefluorescentquantitative-polymerasechainreaction,qrt-pcr)對部分基因差異表達分析結(jié)果進行驗證,結(jié)果證實,rna-seq和qrt-pcr兩種方法得到的基因差異表達分析結(jié)果趨勢一致;另一方面,我們隨機選擇部分新轉(zhuǎn)錄本進行反轉(zhuǎn)錄pcr(reversetranscriptionpcr,rt-pcr)驗證,結(jié)果進一步證實了新轉(zhuǎn)錄本的真實存在。參考1826個degs的rpkm(readsperkilobasepermillionmappedreads)值及其在lab-ds和lab-dr品系間的差異倍數(shù),我們最終選取了22個基因作為蚊抗藥性相關(guān)候選基因。其中部分候選基因?qū)儆谝阎每顾幮韵嚓P(guān)基因家族,另一部分屬于潛在新蚊抗藥性相關(guān)基因。基于蚊媒病主要依靠雌蚊傳播,我們使用qrt-pcr方法檢測了這22個基因在實驗室種群lab-ds和lab-dr品系淡色庫蚊雌蚊中的相對表達水平。結(jié)果提示,其中4個基因(chymotrypsin-2,dimethylanilinemonooxygenase,carboxylesterase和venomallergen5)在lab-dr品系較lab-ds品系顯著性高表達(p0.05)。隨后利用商河(shanghe)和孤島(gudao)兩個現(xiàn)場種群標本進行檢測。最終發(fā)現(xiàn)只有venomallergen5在實驗室和兩個現(xiàn)場種群的抗性品系較敏感品系顯著性高表達(p0.05)。因此我們最終確定venomallergen5為后續(xù)功能驗證候選基因。我們采用rt-pcr結(jié)合cdna末端快速擴增(rapidamplificationofcdnaend,race)技術(shù)進行候選基因全長擴增。結(jié)果表明,淡色庫蚊venomallergen5基因序列全長912bp,包含開放閱讀框(openreadingframe,orf)765bp,共編碼254個氨基酸(genbank登錄號:kf723295.1)。其推導的氨基酸序列與致倦庫蚊(culexpipiensquinquefasciatus)、埃及伊蚊(aedesaegypti)、岡比亞按蚊(anophelesgambiae)、黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)直系同源基因的一致性分別為100%、70.8%、43.85%和32.95%。淡色庫蚊venomallergen5編碼的蛋白包含一個scp樣細胞外蛋白結(jié)構(gòu)域(spermcoatingprotein-likeextracellularproteindomain),屬于scp超家族。為了證實venomallergen5與蚊抗藥性相關(guān),我們隨后進行了體外和體內(nèi)功能驗證。首先我們將外源性pib/v5-his-venomallergen5質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染入蚊細胞內(nèi),提高venomallergen5基因表達水平,用cck-8試劑盒檢測不同濃度溴氰菊酯處理后蚊細胞的存活率,結(jié)果表明venomallergen5高表達能夠顯著降低蚊細胞對溴氰菊酯的敏感性(p0.05);在另一方面,我們將針對venomallergen5設計的sirna40顯微注射入淡色庫蚊雌蚊原體腔內(nèi),敲低venomallergen5基因表達水平,用who成蚊接觸筒法檢測0.05%溴氰菊酯藥膜暴露后雌蚊的存活率,結(jié)果表明venomallergen5低表達能夠顯著增加雌蚊對溴氰菊酯的敏感性(p0.05)。這些結(jié)果表明,venomallergen5是一個新的蚊抗藥性基因,值得我們進一步研究。我們檢測了venomallergen5在四個不同溴氰菊酯抗性水平雌蚊品系中的相對表達水平。四個品系蚊的半數(shù)致死濃度(50%larvallethalconcentrations,lc50)分別為0.03、0.85、3.7和7.0mg/l。結(jié)果表明,venomallergen5在3個抗性品系中的基因表達水平分別是敏感品系的3.3、4.7和29.7倍(p0.05)。在現(xiàn)場檢測結(jié)果中,venomallergen5基因表達水平在商河(shanghe)和孤島(Gudao)現(xiàn)場種群抗性品系(resistant strain)較敏感品系(susceptible strain)顯著性高表達(P0.05),差異倍數(shù)為60.58和7.34。這些結(jié)果提示,venom allergen 5有望成為蚊抗藥性檢測靶標。我們最后檢測了venom allergen 5在不同發(fā)育階段(卵、1-4齡幼蟲、蛹和成蚊)淡色庫蚊中的相對表達水平。結(jié)果表明,venom allergen 5在淡色庫蚊所有發(fā)育階段均表達。在卵、雌蚊和雄蚊階段,venom allergen 5在Lab-DR品系中的基因表達水平分別是Lab-DS品系的2.24、3.3和12.3倍(P0.05)。本研究為蚊抗藥性機制研究提供了重要分子基礎(chǔ),也為現(xiàn)場抗藥性檢測提供了大量候選基因;并證實venom allergen 5是一個新的蚊抗藥性基因,有望成為蚊抗藥性檢測靶標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R384.1

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本文編號：1571722