本文關(guān)鍵詞：ADH1基因與白念珠菌耐藥性和致病力的相關(guān)性研究　出處：《暨南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：白念珠菌易于感染、難以防治的主要原因在于其致病機制復(fù)雜且耐藥現(xiàn)象嚴重。近年來,國內(nèi)外研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新的基因可能與白念珠菌的致病過程或耐藥機制相關(guān),因此,深入研究這些基因的具體功能對進一步了解白念珠菌的致病機理并緩解其耐藥現(xiàn)狀具有重要意義。目的近年來已有零星報道推測乙醇脫氫酶I(Alcohol dehydrogenase I,adh1p)的編碼基因ADH1可能與白念珠菌的致病力和耐藥性相關(guān),本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),ADH1基因的表達產(chǎn)物Adh1p可能參與白念珠菌對唑類藥物耐藥,但這些推論迄今尚無直接證據(jù)支持。因此,本課題通過直接敲除白念珠菌ADH1的雙等位基因,旨在直接證實ADH1基因是否確實影響菌株自身的致病力及其對藥物的敏感性,并初步探討其對線粒體有氧呼吸的影響,為今后臨床上白念珠菌感染的防治及新型抗真菌藥物的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。方法第一部分:首先采用SAT1-Flipper基因敲除策略構(gòu)建白念珠菌ADH1基因缺失菌和回復(fù)菌,該方法以標準菌SC5314為親本菌,諾爾斯菌素(nourseothricin,NAT)為篩選標記,pSFS2為載體構(gòu)建敲除質(zhì)粒,通過兩輪同源重組分別替代目的基因的兩條等位基因,并以套式PCR的方法進行鑒定。隨后進行菌株生長動力學實驗,將親本菌、基因缺失菌和回復(fù)菌分別等濃度培養(yǎng),在不同的時間點測量各菌株的OD600值,從而繪制各菌株的生長曲線并計算倍增時間。第二部分:分別通過酵母菌微量液基稀釋法CLSI M27-A3、M27-S4和瓊脂點板實驗(Spot assay),觀察并測定各菌株對氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)、伏立康唑(voriconazole,VRC)、酮康唑(ketoconazole,KCZ)、兩性霉素B(amphotericin B,AmB)和卡泊芬凈(Caspofungin)等抗真菌藥物的最低抑菌濃度(MIC80)和菌落生長情況,以判斷ADH1基因的缺失對不同機制抗真菌藥物體外敏感性的影響。第三部分:除藥物敏感性實驗外,本課題同時通過一系列實驗從不同層面考察ADH1基因缺失對白念珠菌致病力的影響。(1)菌絲形成實驗:分別將各菌株置于四種常用的固體和液體菌絲誘導培養(yǎng)基(Spider、Lee’s、YPD+10%FBS和SLAD)中培養(yǎng),以考察ADH1基因?qū)z形成能力的影響;(2)生物膜形成實驗:采用XTT還原法測定各菌株在RPMI-1640液體培養(yǎng)基中的生物膜形成情況,以考察ADH1基因?qū)ι锬ば纬赡芰Φ挠绊?(3)體外粘附實驗和細胞表面疏水性實驗:分別將各菌株置于Spider和YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),以考察ADH1基因?qū)Π啄钪榫毎恼掣侥芰拖鄬κ杷缘挠绊?(4)實時熒光定量PCR(Real-Time RT PCR)實驗:考察并分析目的基因敲除前后菌絲和粘附特異性相關(guān)基因ALS1、ALS3、HWP1和CSH1 mRNA水平的表達情況;(5)體內(nèi)感染實驗:分別以小鼠,秀麗隱桿線蟲和蠟螟模型作為體內(nèi)感染模型,考察ADH1基因在不同的體內(nèi)環(huán)境中對菌株致病力的影響。第四部分:分別通過不同的熒光染料試劑盒檢測ADH1基因缺失后白念珠菌細胞內(nèi)線粒體膜電位水平、ATP含量和內(nèi)源性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的變化,初步考察ADH1基因?qū)�粒體有氧呼吸的影響。結(jié)果第一部分:采用SAT1-Flipper基因敲除策略首先成功構(gòu)建了白念珠菌ADH1基因缺失菌ADH1M2B(adh1Δ/Δ)和回復(fù)菌ADH1ReB(adh1Δ/ADH1)。生長動力學實驗結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB相比,ADH1M2B在對數(shù)生長期的的倍增時間差異不大,且SC5314和ADH1ReB的生長無明顯差異,說明ADH1基因敲除后并沒有顯著限制菌株的生長。第二部分:微量液基稀釋法和Spot assay實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1M2B對多種唑類抗真菌藥物FLC、ITR、KCZ和VRC,多烯類抗真菌藥物AmB和丙烯胺類抗真菌藥物卡泊芬凈的MIC80表現(xiàn)為無變化或僅降低一個濃度梯度,差異無統(tǒng)計學意義,且菌落生長狀態(tài)基本無差異,說明ADH1基因缺失后,菌株對上述多種抗真菌藥物的敏感性基本無影響。第三部分:菌絲形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與SC5314比較,ADH1M2B在四種液體或固體菌絲誘導培養(yǎng)基中的菌絲形成能力均顯著減弱,在液體培養(yǎng)基中只能形成芽孢或很短的假菌絲且在固體培養(yǎng)基中形成的菌落邊緣光滑無放射性菌絲,而當ADH1基因回復(fù)時,菌絲的形成能力也得以回復(fù),說明ADH1基因可能是影響白念珠菌菌絲形成的關(guān)鍵基因;生物膜形成實驗結(jié)果顯示,與SC5314比較,ADH1M2B在RPMI-1640液體培養(yǎng)基中生物膜形成能力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而ADH1ReB與SC5314的生物膜形成能力相似,差異無統(tǒng)計學意義,由此說明,ADH1基因?qū)Π啄钪榫锬ば纬善鹬匾饔?體外粘附實驗和細胞表面疏水性實驗結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1M2B在體外的粘附能力和細胞表面相對疏水性菌顯著減弱,說明ADH1基因可顯著影響白念珠菌細胞的粘附能力和細胞表面相對疏水性;Real-Time RT PCR實驗結(jié)果示,與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1基因敲除后菌株內(nèi)重要致病力相關(guān)基因ALS1,ALS3,HWP1和CSH1的mRNA表達水平均顯著下調(diào),進一步證實ADH1基因與菌絲形成和粘附相關(guān);體內(nèi)感染實驗結(jié)果證實,與SC5314和ADH1ReB比較,ADH1基因缺失后,小鼠、秀麗隱桿線蟲和蠟螟的生存時間均明顯延長,且小鼠的臟器組織負荷菌量顯著減少,腎臟病理損傷明顯減弱,說明ADH1基因可顯著降低白念珠菌體內(nèi)模型的致病力。第四部分:線粒體能量代謝相關(guān)實驗結(jié)果初步證實,作為白念珠菌無氧酵解關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶Ⅰ的編碼基因,ADH1缺失對細胞內(nèi)線粒體有氧氧化有顯著影響,具體表現(xiàn)為線粒體膜電位水平和ATP含量均顯著降低,內(nèi)源性活性氧(ROS)水平顯著升高。結(jié)論本課題通過直接敲除白念珠菌ADH1的雙等位基因,并進行一系列表型研究,發(fā)現(xiàn)該基因缺失后對多種常見抗真菌藥物的敏感性無明顯影響,但可顯著減弱白念珠菌在體內(nèi)和體外的致病力,并證實致病力變化與菌株生長動力無關(guān),同時,本實驗初步發(fā)現(xiàn)作為無氧酵解關(guān)鍵酶的編碼基因,ADH1缺失對菌株線粒體有氧呼吸有明顯影響,為下一步深入研究其對致病力影響的作用機制是否與線粒體有氧呼吸相關(guān)提供新的思路和線索。
[Abstract]:In recent years , it has been found that the gene ADH1 of the ADH1 gene may be involved in the pathogenesis of Candida albicans and its resistance to drug resistance . In order to determine the effect of the deletion of ADH1 gene on the in vitro susceptibility to antifungal drugs of different mechanisms , the third part : In addition to the drug sensitivity experiment , the effect of ADH1 gene deletion on the pathogenicity of Candida albicans was investigated from different levels through a series of experiments . ( 1 ) The effect of ADH1 gene on the formation ability of Candida albicans was investigated by means of XTT reduction method . The results showed that ADH1 gene had a significant effect on the formation and adhesion of Candida albicans . The results showed that the ADH1 gene had a significant effect on the formation and adhesion of Candida albicans . The results showed that ADH1 gene could significantly decrease the adhesion ability of Candida albicans and the relative hydrophobicity of cell surface . The results showed that the change of pathogenicity was not related to the growth kinetics of the strain . At the same time , it was found that the deletion of ADH1 was a key enzyme in anaerobic yeast . The deletion of ADH1 had a significant effect on the mitochondrial aerobic respiration of the strain , and it was possible to provide a new idea and clue for the next study on whether the mechanism of the effect of ADH1 was related to mitochondrial aerobic respiration .

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R379.4

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本文編號：1371699