發(fā)布時間：2018-01-02 19:31

  本文關(guān)鍵詞：利用大鼠模型定位先天性巨結(jié)腸癥及色素異常相關(guān)易感基因的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 先天性巨結(jié)腸癥 色素異常 QTL Ednrb 修飾位點

【摘要】：神經(jīng)嵴是脊椎動物胚胎發(fā)育早期短暫存在的一個結(jié)構(gòu),神經(jīng)嵴細胞經(jīng)遷移、增殖和分化等過程可發(fā)育成多種不同組織細胞,其中包括腸神經(jīng)節(jié)細胞和色素細胞。神經(jīng)嵴細胞遷移、增殖和分化過程復(fù)雜,受多個信號通路調(diào)控,涉及多個基因。這些調(diào)控基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異或表達量的變化均可導(dǎo)致神經(jīng)嵴細胞來源的腸神經(jīng)節(jié)細胞和色素細胞發(fā)育障礙,引發(fā)先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung’s disease,HSCR)和皮毛顏色異常。HSCR又稱無神經(jīng)節(jié)性巨結(jié)腸(aganglionic megacolon),是一種可遺傳的、人獸共有的腸道發(fā)育異常,病因是胚胎發(fā)育早期神經(jīng)嵴細胞分化移行障礙導(dǎo)致腸道神經(jīng)節(jié)細胞缺損,受累腸道節(jié)律性收縮蠕動功能異常,腸內(nèi)容物排出受阻,近端腸管繼發(fā)性擴張形成。HSCR病因復(fù)雜,表型多變,多為散發(fā),不遵守孟德爾遺傳定律,被認為是多基因互作的結(jié)果。已有的研究結(jié)果只能解釋部分病例。因此,探尋HSCR未知易感基因和修飾位點或修飾基因具有重要意義。動物皮毛的顏色由神經(jīng)嵴細胞來源的、黑色素細胞分泌的黑色素種類和數(shù)量共同決定。黑色素細胞發(fā)育異常不但會引起機體皮毛顏色異常,還被認為與多種人類疾病相關(guān),如惡性黑色素瘤、帕金森病等。黑色素細胞發(fā)育過程復(fù)雜,受多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,但相關(guān)調(diào)控機制仍未完全研究清楚。本研究以表型嚴重程度不同的AGH和LEH兩個品系的HSCR大鼠模型為親本產(chǎn)生F1代,再互交制作F2代群體,在F2代進行HSCR和色素異常相關(guān)QTL定位,進一步利用生物信息學(xué)分析方法在其置信區(qū)間內(nèi)篩選可能的HSCR和色素異常相關(guān)基因,通過對候選基因進行測序分析來尋找在兩個大鼠品系中存在的遺傳差異,通過載體構(gòu)建、細胞培養(yǎng)、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對相關(guān)遺傳差異進行功能性分析,進一步研究其修飾HSCR表型的機理。為進一步鑒定兩個基因的互作修飾HSCR表型和色素異常表型,本研究還進行了基因敲除細胞株的構(gòu)建和電穿孔法將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9的mRNA和g RNA的RNA導(dǎo)入小鼠胚胎制作基因敲除小鼠的初步探究。本研究主要得到以下結(jié)果:(1)AGH-Ednrbsl/sl大鼠腸神經(jīng)節(jié)細胞缺損嚴重,LEH-Ednrbsl/sl個體癥狀較輕,F1-Ednrbsl/sl個體腸神經(jīng)節(jié)細胞缺失程度較AGH-Ednrbsl/sl個體得到緩解,說明在LEH遺傳背景中存在與Ednrb互作共同影響腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育的修飾基因或修飾位點。(2)在大鼠2號染色體(Chromosome,Chr)上定位到一個與HSCR顯著相關(guān)的qtl位點,最高lrs值(d2mgh14)達25.0,該位點造成的變異占總變異的15%。對于該位點,leh等位基因?qū)scr表型表現(xiàn)為抵抗作用,agh純合個體hscr癥狀最嚴重,leh純合個體hscr癥狀最輕,agh/leh雜合個體hscr癥狀則介于兩者之間。(3)在chr2上的hscr相關(guān)qtl位點的置信區(qū)間內(nèi)篩選出三個hscr相關(guān)候選基因:slc45a2、gdnf和ptger4。測序發(fā)現(xiàn)gdnf基因第一起始密碼子上游第613位堿基處存在c/t突變(g.76896910ct),其中,leh群體為c,agh群體為t。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測后發(fā)現(xiàn)該突變位點使agh大鼠gdnf基因啟動子活性明顯降低。提示agh與leh品系間ednrbsl/sl大鼠腸神經(jīng)節(jié)缺損型存在差異可能歸因于gdnf基因與ednrb基因的互作。(4)agh-ednrbsl/sl大鼠毛色幾乎全白,leh-ednrbsl/sl大鼠頭部有較大一塊著色,f1代中ednrbsl/sl個體色素異常癥狀得到緩解,說明在leh遺傳背景中存在與ednrb互作共同影響黑色素細胞發(fā)育的修飾位點或修飾基因。(5)在大鼠chr7上定位到一個與色素異常極顯著相關(guān)的qtl位點,最高lrs值(d7got23)為45.0,該位點造成的變異占總變異的26%,agh純合個體色素異常程度最嚴重,leh純合個體色素異常程度與agh/leh雜合個體色素異常嚴重程度相當。另外,d7got23位點分別與d14mit4位點及d3rat78位點存在互作效應(yīng),共同修飾色素異常表型。其中,在d7got23位點與d3rat78位點上,均是leh等位基因?qū)ι禺惓４嬖诘挚棺饔?而在d14mit4位點上是agh基因型對色素異常存在抵抗作用。(6)在大鼠chr7色素異常相關(guān)qtl位點的置信區(qū)間內(nèi)篩選得到3個色素異常相關(guān)候選基因:lgr5、wif1和kitlg基因。同線性分析發(fā)現(xiàn)該qtl位點與小鼠chr10上一個色素異常相關(guān)的qtl位點同源,并且發(fā)現(xiàn)已知的毛色異常易感基因kitlg基因位于該區(qū)域。在agh和leh品系的lgr5和wif1基因外顯子區(qū)及上游部分啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)差異;而在kitlg基因編碼區(qū)檢測到一個錯義突變(g.42338824ct),該突變造成對應(yīng)氨基酸由脯氨酸變成絲氨酸。在線軟件sitf預(yù)測該突變可能影響其蛋白質(zhì)功能。結(jié)果提示agh-ednrbsl/sl大鼠與leh-ednrbsl/sl大鼠毛色表型的差異可能歸因于kitlg基因與ednrb基因互作。(7)基于crispr/cas9基因編輯技術(shù),分別設(shè)計并驗證得到用于敲除大鼠/小鼠ednrb基因和gdnf基因的grna,分別為:1)rat-ednrb-grna:gagccggtgcggacg-cgcct;2)rat-gdnf-grna:cgcttcgagaagcgtcttac;3)mouse-ednrb-grna:gagccggtgcggacgcgcct;4)mouse-gdnf-grna:gtctacggagaccggat-ccg。并篩選得到大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞系ednrb基因敲除單克隆細胞株和gdnf基因敲除單克隆細胞株。為后期從細胞水平上研究ednrb(gdnf)基因突變對gdnf(ednrb)基因及其它腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育相關(guān)基因表達的影響及制作ednrb和gdnf基因敲除小鼠奠定基礎(chǔ)。(8)體外轉(zhuǎn)錄得到crispr/cas9系統(tǒng)組件及egfpmrna。在體外用電穿孔法將羅丹明導(dǎo)入1.5 d小鼠胚胎時,摸索到的最佳條件為:電壓110 v,脈沖時間5 ms,脈沖間隔為50 ms,脈沖次數(shù)為3。此時,正常發(fā)育且成功電轉(zhuǎn)羅丹明效率可達27%。電壓過高或過低電轉(zhuǎn)效率均急劇下降。這些結(jié)果為后期利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制作基因敲除鼠以研究Gdnf與Ednrb基因、Kitlg與Ednrb基因互作影響腸神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育和黑色素細胞發(fā)育的遺傳機制奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to further identify the genetic differences between the two genes , it is suggested that the development of HSCR may lead to the development of neural crest cells , such as malignant melanoma , Parkinson ' s disease and so on . ( 3 ) There was a significant difference in the expression of the gdnf gene in the rat intestine . ( 8 ) To study the effect of ednrb ( gdnf ) gene mutation on gdnf ( ednrb ) gene and other intestinal ganglion cell development - related gene expression in vitro .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R722.1;R-332
，

本文編號：1370643