本文關(guān)鍵詞：鹽皮質(zhì)激素受體在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）是一種原因不明的進(jìn)展性、致死性的纖維化性間質(zhì)性肺炎。目前，IPF的發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏有效治療手段。IPF患者診斷后的平均生存時(shí)間僅為2.5-3.5年[1]。近些年來(lái)，涌現(xiàn)出大量關(guān)于IPF發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究。鹽皮質(zhì)激素受體（Mineralocorticoid receptor, MR）是一種典型的胞核甾體類(lèi)激素受體，醛固酮是其選擇性配體。MR在腎臟、肺臟、心、血管、腦以及免疫系統(tǒng)等部位均有表達(dá)[2]。近些年研究表明，MR參與了巨噬細(xì)胞的活化表型調(diào)節(jié)[3]，MR與纖維化過(guò)程有著密切的聯(lián)系[4]。但是MR是否參與了肺纖維化的發(fā)病過(guò)程及其作用機(jī)制尚不明確。 本研究擬使用博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，首先，檢測(cè)MR在肺纖維化過(guò)程中mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討其在肺纖維化進(jìn)展過(guò)程中的作用；其次，通過(guò)使用MR抑制劑（螺內(nèi)酯）阻斷MR，觀察阻斷MR后，肺纖維化程度的變化；最后，通過(guò)檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscleactin, α-SMA）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）的表達(dá)水平，探討MR在肺纖維化發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮其病生理作用的分子機(jī)制。此外，采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定干擾MR基因的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，觀察對(duì)其增殖和凋亡等生物學(xué)特性的影響。 方法：1）126只6-8周齡C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control）、博來(lái)霉素組（Bleo）和螺內(nèi)酯干預(yù)組（Bleo+Spiro），每組42只。氣管內(nèi)一次性滴注博來(lái)霉素（2.5mg/Kg）溶液建立實(shí)驗(yàn)性小鼠肺纖維化模型，對(duì)照組采取氣管內(nèi)滴注同等體積生理鹽水。螺內(nèi)酯干預(yù)組按螺內(nèi)酯20mg/Kg經(jīng)灌胃給藥。于模型建立完成后第12h、1d、2d、3d、7d、14d、28d處死小鼠，取出肺臟，用于進(jìn)一步分析。使用生理鹽水對(duì)每組一半的小鼠肺臟進(jìn)行常規(guī)灌洗。灌洗后的肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)切片（5μm），采用H.E.染色、Masson染色的方法進(jìn)行組織學(xué)分析。采用α-SMA免疫熒光染色分析小鼠肺臟中α-SMA表達(dá)水平。未經(jīng)灌洗的肺組織用于mRNA分析和Western-Blot檢測(cè)，采用Real-time PCR法檢測(cè)各組肺組織中Col1(Collagen1)、Col3(Collagen3)、TGF-β、MCP-1及MR mRNA的表達(dá)水平。采用Western-Blot法檢測(cè)MR蛋白表達(dá)水平。 2）針對(duì)MR基因設(shè)計(jì)合成重組MR shRNA質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至RAW264.7，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。細(xì)胞分為3組：野生型(WT)、陰性對(duì)照（NC）組和干擾（shMR）組。熒光顯微鏡下觀察確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MR mRNA的表達(dá)；CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況。 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示。組間的比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1）H.E.及Masson染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，博來(lái)霉素組及螺內(nèi)酯干預(yù)組小鼠在染博來(lái)霉素后經(jīng)歷了典型的急性炎癥期（12h-3d）、纖維化進(jìn)展期（14d）和纖維化晚期（28d）。較博來(lái)霉素組相比，螺內(nèi)酯干預(yù)后的小鼠肺臟早期炎癥反應(yīng)明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；在纖維化進(jìn)展期（14d），纖維化程度顯著減輕（P0.001）。 2）α-SMA免疫熒光染色結(jié)果顯示，在給予博來(lái)霉素14d后，博來(lái)霉素組小鼠肺臟中α-SMA表達(dá)量顯著高于螺內(nèi)酯干預(yù)組和對(duì)照組。 3）博來(lái)霉素組小鼠在急性炎癥期（12h-3d）肺組織中MR mRNA表達(dá)水平升高，明顯高于對(duì)照組（P0.05），隨后逐漸下降，，在第14d降至最低，與對(duì)照組表達(dá)水平接近，而后再次升高，在纖維化晚期（28d）明顯高于對(duì)照組（P0.05）。 螺內(nèi)酯干預(yù)可以有效降低MR mRNA表達(dá)水平。螺內(nèi)酯干預(yù)組小鼠在給予博來(lái)霉素后第14d，Col1和Col3mRNA表達(dá)水平顯著降低（P0.05）。 博來(lái)霉素組小鼠在急性炎癥期（12h-3d），肺組織中MCP-1mRNA的表達(dá)顯著增高（P0.05）。隨著時(shí)間推移，逐漸下調(diào)。螺內(nèi)酯干預(yù)可以下調(diào)MCP-1mRNA的表達(dá)。 在給予博來(lái)霉素后第3d，與博來(lái)霉素組相比，螺內(nèi)酯干預(yù)組小鼠肺組織中TGF-β mRNA的表達(dá)顯著增高（P0.05）；第14d，博來(lái)霉素組小鼠肺組織中TGF-β mRNA的表達(dá)水平則明顯高于螺內(nèi)酯干預(yù)組（P0.05）。 4）博來(lái)霉素組小鼠肺組織中MR蛋白表達(dá)水平在急性炎癥期（12h-3d）升高，明顯高于對(duì)照組（P0.05），隨后逐漸下降。至第7d，MR蛋白表達(dá)水平迅速下調(diào)，在給予博來(lái)霉素14d后降至最低，與對(duì)照組表達(dá)水平接近，至纖維化晚期（28d）再次升高，顯著高于對(duì)照組（P0.05）。螺內(nèi)酯干預(yù)可以有效抑制MR蛋白水平的表達(dá)。 5）MR shRNA能明顯抑制RAW264.7細(xì)胞的MR基因表達(dá)，抑制率70%以上。 6）從第3天開(kāi)始，shMR組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯低于NC和WT組(P0.05)，說(shuō)明MR shRNA能明顯抑制細(xì)胞增殖。WT、NC和shMR組的增殖指數(shù)分別為（37.2±0.5）%、（37.5±1.6）%和（31.0±1.3）%，shMR組的細(xì)胞周期出現(xiàn)改變，S期和G2/M期比例明顯下降，增殖指數(shù)下降（P0.05）。 7）WT、NC和shMR組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.18±0.36）%、（6.65±0.81）%和（7.70±1.34）%，shMR組略高于NC組，但二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。 結(jié)論：1）MR的表達(dá)在博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化過(guò)程中呈現(xiàn)明顯的動(dòng)態(tài)變化，并參與了肺纖維化的發(fā)病過(guò)程；2）阻斷MR在纖維化進(jìn)展期（14d）可以明顯減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度；3）MR可能通過(guò)在急性炎癥期誘導(dǎo)分泌大量MCP-1，激活炎癥反應(yīng)，并在纖維化進(jìn)展期，促進(jìn)TGF-β的表達(dá)，促進(jìn)了肺纖維化的進(jìn)展，此外，MR還可能通過(guò)直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。4）MR shRNA能夠明顯抑制RAW264.7細(xì)胞增殖，但對(duì)其凋亡無(wú)明顯影響。
【關(guān)鍵詞】：博來(lái)霉素 肺纖維化 螺內(nèi)酯 鹽皮質(zhì)激素受體 RNA干擾 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R563.9
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-32
• 結(jié)果32-36
• 附圖36-47
• 附表47-48
• 討論48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述 鹽皮質(zhì)激素受體與特發(fā)性肺纖維化56-69
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 石晶;梁偉;陳鋮;賈俊亞;丁國(guó)華;;醛固酮灌注誘導(dǎo)大鼠腎小球損傷[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 周定;SHRs醛固酮水平對(duì)腎臟纖維化與CD2AP的影響和依普利酮的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

2 萬(wàn)琳媛;超聲評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化性下肢動(dòng)脈疾病患者外周動(dòng)脈及左室改變[D];華中科技大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：330901