【摘要】：支氣管哮喘是目前嚴重威脅人類公共健康最常見的慢性肺部疾病之一,主要以反復發(fā)作性的氣急、胸悶、咳嗽等為主要臨床癥狀,常在夜間和(或)清晨發(fā)作,如果長期反復發(fā)作則可致氣道重塑導致氣道增厚與狹窄,最終成為阻塞性肺氣腫。目前尚未完全明確哮喘的具體發(fā)病機制,有研究表明支氣管上皮細胞的脫落和損傷參與了哮喘的病理過程,支氣管上皮細胞的凋亡為哮喘發(fā)病的起始環(huán)節(jié)。穿孔素(PFP)和顆粒酶B(GzmB)主要由細胞毒性T細胞(CTL細胞)和自然殺傷細胞(NK細胞)分泌,是介導細胞凋亡的重要因子,其在哮喘大鼠肺組織中的表達高低以及其對支氣管上皮細胞凋亡的誘導作用目前尚不明確。重組人生長激素(rhGH)為人工合成的一種多肽,其能夠通過復雜的機制抑制相應細胞的凋亡從而達到治療目的。本實驗通過建立大鼠哮喘模型并應用rhGH進行干預,觀察PFP與GzmB的在肺組織中的表達情況、上皮細胞凋亡變化及其相互關(guān)系,以期為臨床治療哮喘提供相應的理論依據(jù)。 目的 本實驗通過建立哮喘大鼠模型,探討哮喘大鼠支氣管上皮細胞凋亡情況、肺組織中PFP、GzmB的表達情況及rhGH的干預作用。 材料和方法 1實驗動物分組和哮喘模型制作 選取健康雄性4-6周齡SD大鼠30只,遵照隨機原則分為正常對照組、哮喘模型組和rhGH干預組,每組各10只。第1,8,15天哮喘組和干預組大鼠分別應用新鮮調(diào)配的10%卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液1ml(其中卵清蛋白100mg,氫氧化鋁100mg)腹腔注射,致敏3次,對照組大鼠應用生理鹽水1ml進行腹腔注射。第16d開始,分別應用1%卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液5ml給哮喘組和干預組大鼠霧化吸入30分鐘,隔日進行1次共霧化20次；干預組各大鼠在第11次霧化吸入混懸液前30分鐘給予皮下注射rhGH(1.33KU/Kg),共注射10次；對照組大鼠每次霧化吸入生理鹽水5ml 30分鐘,隔日1次,共進行20次。 2肺組織標本制備 最后一次霧化吸入后各組大鼠分別腹腔注射苯巴比妥100mg處死,迅速解剖取右肺置于冷凍管中并放入液氮灌中凍存,做RT-PCR用。應用無菌生理鹽水和4%甲醛溶液對左肺進行灌注和沖洗,甲醛固定后行石蠟包埋。分別于取垂直和平行氣道兩個方向取材切片,作HE染色及TUNEL原位細胞凋亡檢測。 3原位細胞凋亡結(jié)果分析 于光鏡下分析結(jié)果：隨機選取5個高倍鏡野(×400并且含有同等級別支氣管)的支氣管上皮總數(shù)及陽性染色上皮細胞數(shù)(著色為棕黃色),按照公式：陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%以計算上皮細胞凋亡指數(shù)。 4 RT-PCR分析 將凍存的肺組織采用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應用事先設(shè)計好的引物擴增目的片段PFP、GzmB與GAPDH.進行瓊脂糖凝膠電泳后,用Band Scan 5.0凝膠分析軟件分別測定PFP、GzmB與GAPDH的灰度值,并分別以與兩者的比值作為該大鼠的代表值。 5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)分析采用pearson相關(guān)行檢驗；以a=0.05為檢驗水準。 結(jié)果 1病理學改變 正常對照組肺組織形態(tài)學無異常改變。哮喘模型組大鼠肺組織HE染色后可見支氣管管腔中有大小不一的粘液栓形成,支氣管上皮細胞水腫、脫落、結(jié)構(gòu)不規(guī)則；杯狀細胞增多,黏膜下層及平滑肌增厚；氣道壁及肺間質(zhì)有大量的炎性細胞浸潤,以嗜酸性粒細胞及淋巴細胞為主；rhGH干預組炎癥反應較哮喘組輕,杯狀細胞減少,黏膜下層及平滑肌增厚較哮喘組減輕。2上皮細胞凋亡的變化 正常對照組支氣管上皮凋亡(TUNEL原位細胞凋亡染色為棕黃色)較少；哮喘組支氣管上皮有較多凋亡,高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；應用rhGH干預后支氣管上皮細胞凋亡高于正常對照組,但明顯低于哮喘組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3 RT-PCR結(jié)果 哮喘組和干預組的PFP及GzmB表達量均較正常對照組增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05), rhGH干預組的兩者的表達量均較哮喘組減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4相關(guān)性分析 哮喘大鼠肺組織中PFP表達量與支氣管上皮細胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.800, P 0.05), GzmB表達量與支氣管上皮凋亡指數(shù)亦呈正相關(guān)(r=0.806,P0.05)。 結(jié)論 (1)PFP及GzmB通過促進支氣管上皮細胞的凋亡參與了支氣管哮喘的發(fā)生及發(fā)展過程。 (2) rhGH可通過減少PFP及GzmB的表達以緩解氣道炎癥及氣道重塑。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R562.25

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本文編號：2774945