【摘要】： 第一部分人肺泡上皮對肺泡內(nèi)凝血的調(diào)節(jié)作用 目的蛋白C通路(PC pathway)是體內(nèi)調(diào)節(jié)凝血的主要途徑。有研究顯示，急性肺損傷(ALI)時肺泡內(nèi)凝血活動增強，且伴有肺泡內(nèi)的蛋白C通路的顯著變化。本課題旨在研究人肺泡上皮細胞能否表達和釋放活化蛋白C所需的兩個受體一凝血酶調(diào)節(jié)素(TM)和內(nèi)皮細胞蛋白C受體(EPCR)。并初步探討其釋放的機制。方法1)采集急性肺損傷(ALI)和靜水壓性肺水腫(hydrostatic pulmonary edema)患者的肺泡水腫液和血漿，采用ELISA方法測定其中EPCR的含量，并與其中TM含量作相關性分析。2)體外培養(yǎng)人肺泡上皮樣A549細胞株和原代分離的人肺泡Ⅱ型上皮細胞并給予不同的病理刺激后測定細胞培養(yǎng)液及細胞裂解液中EPCR和TM蛋白含量的變化以及由此引起的肺泡細胞表面活化蛋白C(APC)生成的變化。3)測定肺泡上皮細胞經(jīng)佛波醇(PMA)及金屬蛋白酶抑制劑等處理后釋放EPCR和TM量的變化，探討可能的釋放機制。4)用real-timePCR檢測EPCR和TM在肺泡上皮細胞的表達。結果1)ALI患者的肺泡水腫液和血漿中的EPCR含量均高于靜水壓性肺水腫液，ALI肺泡水腫液中的EPCR含量顯著高于血漿中的含量，且其含量高低與疾病的嚴重程度成正比，結合以往的研究結果，ALI患者肺泡水腫液中的EPCR含量與TM含量成正相關，提示肺泡上皮可能為肺泡內(nèi)TM和EPCR的肺內(nèi)來源。2)肺泡上皮細胞能表達活性TM和EPCR，并能在其表面活化蛋白C。炎癥因子混合物cytomix(TNF-α，IL-1β，IFN-γ)刺激促進上皮細胞釋放EPCR和TM增多，并呈時間和劑量依賴模式，而細胞表面活化蛋白C的活力隨EPCR和TM的釋放而下降。3)金屬蛋白酶抑制劑TAPI-0和GM6001可以抑制上皮細胞釋放EPCR和TM，并部分恢復蛋白C的活化功能，提示EPCR和TM的釋放是金屬蛋白酶水解介導的。4)LPS和cytomix刺激導致EPCR和TM釋放的速度不同，LPS引起的釋放速度較快，可以被TIMP-3抑制，而不能被TIMP-1，2抑制，提示腫瘤壞死因子—α轉化酶(TACE／ADAM-17)介導了快速釋放過程，而Cytomix引起的釋放速度較慢，均不能被TIMP-1、2、3抑制，提示不同金屬蛋白酶參與其中。5)肺泡上皮細胞表達TM和EPCR mRNA，但cytomix刺激不改變基因表達水平。結論我們的實驗首次采用原代人肺泡上皮細胞證實了蛋白C通路在人肺泡上皮存在。肺泡上皮細胞在受到外界病理刺激后能通過釋放EPCR和TM從而改變肺泡上皮表面APC的含量，而影響肺泡內(nèi)肺泡內(nèi)凝血和炎癥過程。初步研究發(fā)現(xiàn)EPCR和TM的釋放與細胞內(nèi)的金屬蛋白酶水解過程有關，LPS介導的EPCR和TM釋放是由TACE／ADAM-17介導的，而cytomix引起的EPCR和TM釋放可能是由其他基質(zhì)蛋白酶介導的。我們發(fā)現(xiàn)的肺泡上皮細胞能調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)凝血的功能將為ALI的發(fā)病和治療提供新的思路和策略。 第二部分人肺上皮細胞通過纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)的纖溶狀態(tài) 目的目前認為ALI時肺泡內(nèi)纖溶活性降低主要是由于肺泡內(nèi)增高的PAI-1所致，PAI-1是體內(nèi)主要的纖溶抑制物，本研究旨在探討人肺泡上皮是否能表達并釋放PAI-1并通過其調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)纖溶狀態(tài)。方法1)體外培養(yǎng)A549和人肺泡Ⅱ型上皮細胞，進行細胞表面PAI活性測定來測定肺泡上皮細胞的纖溶活性。2)用ELISA法測定cytomix刺激A549及人肺泡Ⅱ型上皮細胞后肺泡培養(yǎng)液和細胞裂解液中的PAI-1蛋白含量的變化。3)采用Northern Blot法測定肺泡上皮細胞內(nèi)PAI-1mRNA的表達。結果1)炎癥因子刺激使肺泡上皮細胞表面的纖溶活性顯著降低，同時伴隨著PAI-1釋放增加，細胞裂解液中的PAI—1蛋白含量亦增加。2)炎癥因子刺激可上調(diào)PAI-1 mRNA在肺泡上皮中的表達。結論本實驗首次采用原代人肺泡Ⅱ型上皮細胞證實其和A549細胞一樣能表達和釋放PAI-1，炎癥刺激能上調(diào)肺泡細胞PAI—1的表達，引起PAI—1釋放增多，從而降低肺泡表面的纖溶活性，顯示肺泡上皮細胞能通過PAI—1從而實現(xiàn)對肺泡內(nèi)纖溶的調(diào)節(jié)。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R563
【圖文】：

泡上皮對急性肺損傷肺泡內(nèi)凝血和纖溶調(diào)節(jié)作用的研究第一部我們測定隨cytomix作用濃度和時間的改變，蛋白c活化及EPCR、TM變化。結果顯示Zong/mlcytomix刺激A549細胞后蛋白c活化功能隨刺的延長有下降的趨勢，18h時與實驗開始時有顯著差異(p<0.05)，并呈持(圖2)。而隨著cytomix刺激時間的延長，細胞培養(yǎng)液中的EPcR和TM卻呈持續(xù)上升趨勢(圖3)。

時間的延長有下降的趨勢，18h時與實驗開始時有顯著差異(p<0.05)，并呈下降(圖2)。而隨著cytomix刺激時間的延長，細胞培養(yǎng)液中的EPcR和T水平卻呈持續(xù)上升趨勢(圖3)。森森大大大大大大大大一一秘秘秘公刃刃刃刃刃刃刃刃湯湯二份份份畢橄22222金金礴礴礴礴卜飛、.....氣鐫斷!!!備備備備一惰飛飛飛鑄、、03612Tlme(hours)圖2A549細胞的蛋白C活化功能隨cytomix刺激時間延長而下降。*p<o.05vs.oh。

人肺泡上皮對急性肺損傷肺泡內(nèi)凝血和纖溶調(diào)節(jié)作用的研究由于A549細胞的蛋白C活化功能在cytomix刺激18h后出現(xiàn)我們選擇此時IbJ點測定不同劑量的eytomix(l，3，10，20，song/m白C活化功能和TM、EPCR釋放的影響。結果顯示A549細胞的蛋能隨cytomix劑量的增加而降低(圖4)，相反的，細胞培養(yǎng)液中的含量卻呈持續(xù)上升趨勢(圖5)。

【共引文獻】

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本文編號：2757940