發(fā)布時間：2020-05-08 18:06

【摘要】： 第一部分機(jī)械牽張A549細(xì)胞對細(xì)胞活性和穿透素3表達(dá)的影響 研究背景與目的大量資料證實了呼吸機(jī)所致肺損傷(VILI)與機(jī)械牽張應(yīng)力有關(guān),推測其可能機(jī)制是機(jī)械牽張對肺細(xì)胞的直接刺激觸發(fā)、激活或啟動細(xì)胞的牽張敏感基因高表達(dá),其效應(yīng)蛋白-細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等大量產(chǎn)生,從而引發(fā)一系列的生物學(xué)反應(yīng),造成不同程度的生物學(xué)損傷。穿透素-3(PTX3)是一種急性期反應(yīng)蛋白,也是一種炎癥標(biāo)志物,在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中均起著重要作用,并參與了機(jī)械牽張刺激引起的炎癥反應(yīng)過程,且它們基因啟動子序列中均含有牽張反應(yīng)元件,因而我們推測PTX3可能屬于牽張敏感基因。本研究擬選擇人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為研究對象,從細(xì)胞力學(xué)的角度,研究A549在體外周期性機(jī)械牽張作用下細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子分泌的情況,以期為VILI發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù),并為從細(xì)胞水平研究VILI提供一個合適模型。同時以該細(xì)胞模型為基礎(chǔ)在細(xì)胞水平觀察體外機(jī)械牽張對A549細(xì)胞PTX3表達(dá)的影響。 方法本研究采用美國Flexercell公司生產(chǎn)的細(xì)胞柔性基底加載裝置FX4000T,該系統(tǒng)是通過一個真空泵抽吸特制的柔性細(xì)胞培養(yǎng)膜,形成負(fù)壓而使培養(yǎng)膜拉伸應(yīng)變,從而使黏附生長在膜上的細(xì)胞受到張力的作用,模擬機(jī)械通氣對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的力學(xué)刺激,細(xì)胞所受力的大小正比于培養(yǎng)膜的牽拉幅度即應(yīng)變率(%),加載程序由FX 4000計算機(jī)軟件自動控制。對體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞進(jìn)行周期性牽張,觀察不同機(jī)械力和不同牽張時間對細(xì)胞的影響。根據(jù)不同的處理方式分為靜止對照組(C組)和機(jī)械牽張組(A組:6%應(yīng)變率;B組:20%應(yīng)變率),A組和B組其他加載方案均為:頻率0.3Hz,周期性波形為方波,加載時間為1h、2h、4h和6h)。靜止對照組:應(yīng)用“Flexstop”,即一個橡膠塞塞在BioFlex培養(yǎng)板的下面,阻止真空抽吸柔性細(xì)胞培養(yǎng)膜。采用Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡活性,應(yīng)用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測,透射電子顯微鏡檢測和Hoechst33258單染法熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)變化。同時應(yīng)用ELISA法檢測A549細(xì)胞細(xì)胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR檢測肺泡上皮細(xì)胞PTX3 mRNA表達(dá),Western blot檢測PTX3蛋白水平。 結(jié)果與C組相比,牽張1h以上B組A549凋亡和死亡細(xì)胞百分比顯著增加(p0.01),而A組無顯著差異(p0.05),其差異主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡細(xì)胞百分比沒有顯著差異(p0.05)。B組呈時間依賴性地引起A549細(xì)胞凋亡,同時也促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α分泌。與C組相比,B組細(xì)胞PTX3 mRNA表達(dá)和蛋白產(chǎn)生呈時間依賴性增加,B組被牽張2h引起PTX3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,分別增加6.25倍和2.58倍(p0.01),而A組細(xì)胞PTX3基因的表達(dá)沒有影響。 結(jié)論體外過度機(jī)械牽張肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子TNF-α的分泌,并促進(jìn)了PTX3表達(dá),這可能在細(xì)胞力學(xué)水平為VILI提供了實驗依據(jù),同時也為后面從細(xì)胞水平研究VILI的發(fā)病機(jī)制提供了一個可行的模型。 第二部分有效干擾A549細(xì)胞穿透素3表達(dá)的siRNA的篩選 研究背景與目的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)作為特異抑制基因表達(dá)的重要手段,已被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控和基因功能的研究及基因治療。其基本原理是通過是21-23個核苷酸的小片段,即siRNA特異性識別其互補(bǔ)mRNA,促使其降解,使相關(guān)基因處于轉(zhuǎn)錄后基因沉默,從而使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。目前制備siRNA的方法有體外化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、體內(nèi)表達(dá)載體合成等,其中體外化學(xué)合成具有方便簡單的特點(diǎn)�；谏鲜隹紤],本研究旨在篩選有效抑制PTX3表達(dá)的體外化學(xué)合成的siRNA,從而為進(jìn)一步探索其功能,并作為某些疾病的治療手段提供理論依據(jù)。 方法采用體外化學(xué)合成的方法,合成針對PTX3的siRNA各3對、陽性對照、陰性對照和熒光對照FAM-siRNA各1對,用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,用real-time PCR及Western-blot檢測PTX3 mRNA和蛋白表達(dá)的水平。并轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記對照FAM-siRNA后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果脂質(zhì)體2000將siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞的效率為89.18%±3.26%。與空白對照組相比,3對PTX3 siRNA均有效序列顯著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表達(dá)(P0.01),其中針對PTX3最有效siRNA能將PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而陰性對照組PTX3 mRNA和蛋白的表達(dá)均無顯著差別(P0.05)。 結(jié)論化學(xué)合成的siRNA體外應(yīng)用脂質(zhì)體2000能高效轉(zhuǎn)染A549,并篩選最有效干擾目的PTX3基因的siRNA,為進(jìn)一步探索目的基因的功能提供理論依據(jù)。 第三部分干擾穿透素3表達(dá)對機(jī)械牽張引起A549細(xì)胞活性改變的影響 目的研究有效干擾PTX3基因表達(dá)對機(jī)械牽張引起A549細(xì)胞活性改變以及細(xì)胞因子釋放的影響,探討其在VILI中的可能作用。 方法體外培養(yǎng)于包被膠原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培養(yǎng)板的人肺泡上皮細(xì)胞A549,隨機(jī)分為空白對照組、靜止對照組、牽張組、RNAi組、RNAi+牽張組�？瞻讓φ諡槲唇o任何干預(yù)正常培養(yǎng)細(xì)胞;靜止對照組應(yīng)用“Flexstop”阻止?fàn)繌?牽張組采用FX4000T細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)周期性牽張細(xì)胞,其方案為:應(yīng)變率為20%,頻率為0.3Hz,周期性波形為方波,加載時間為4h; RNAi組應(yīng)用lipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染特異靶向PTX3的siRNA;RNAi+牽張組于牽張前12h轉(zhuǎn)染特異靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法檢測A549細(xì)胞PTX3 mRNA表達(dá)的變化;Western blot檢測分泌PTX3蛋白;Annexin V流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡;ELISA法檢測培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子TNF-α水平。 結(jié)果與靜止對照組相比,牽張組A549細(xì)胞PTX3基因和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào),牽張組PTX3mRNA增加7.397±0.276倍(P0.01),牽張組和靜止對照組PTX3蛋白分別為0.647±0.019和1.590±0.060(P0.01)。而與牽張組相比, RNAi+牽張組細(xì)胞PTX3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著抑制。與靜止對照組相比,牽張組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞百分比顯著增加;而與牽張組相比,RNAi+牽張組成活細(xì)胞百分比明顯增加(85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P0.01),凋亡細(xì)胞百分比明顯降低。 結(jié)論周期性機(jī)械牽張可通過上調(diào)人肺泡上皮細(xì)胞PTX3基因和蛋白表達(dá),導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加和過度炎癥反應(yīng),這一現(xiàn)象可能與VILI的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。PTX3作為肺泡上皮細(xì)胞上表達(dá)的機(jī)械牽張敏感基因,從而積極參與了VILI的發(fā)病機(jī)制。 第四部大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺部穿透素3的表達(dá)變化 研究背景與目的呼吸機(jī)所致肺損傷(VILI)是機(jī)械通氣的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計,有22%～39%進(jìn)行機(jī)械通氣病人會發(fā)生VILI,死亡率高達(dá)15%～30%,嚴(yán)重影響患者預(yù)后。大潮氣量機(jī)械通氣時機(jī)械牽張應(yīng)力作為一種炎癥前期刺激,能通過特定的信號通路激起炎癥級聯(lián)反應(yīng),引起VILI。PTX3是新型的促炎癥因子,在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中均起著重要作用,細(xì)胞水平研究結(jié)果顯示,過度機(jī)械牽張能顯著上調(diào)其表達(dá),且基因啟動子序列中均含有牽張反應(yīng)元件,因而我們推測PTX3作為牽張敏感基因,可能在VILI的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。本實驗擬研究大潮氣量機(jī)械通氣對大鼠肺部PTX3表達(dá)的影響。 方法48只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組(C組,n=16,保持正常自主呼吸)、保護(hù)性機(jī)械通氣組(PV組,n=16,潮氣量Vt:6ml/kg,PEEP=3～5cm H2O,呼吸頻率為70次/分)、大潮氣量機(jī)械通氣組(HV組,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0),呼吸頻率為20次/分。其余通氣參數(shù)均一致,即吸呼之比為1∶2 ,吸氧濃度FiO2為35%。頸動脈和頸內(nèi)靜脈切開置管,行監(jiān)測、標(biāo)本采集和液體及麻醉藥的輸注。持續(xù)檢測HR、ECG、有創(chuàng)動脈血壓(ABP)、直腸溫度量監(jiān)測。間斷進(jìn)行血?dú)夥治?計算氧合指數(shù)。機(jī)械通氣4h后處死大鼠。(1)HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)變化;(2)檢測肺組織濕/干重比值(W/D);(3)檢測肺泡灌洗液和血清中蛋白計算肺通透指數(shù)(LPI),ELISA法檢測肺組織勻漿和肺泡灌洗液中TNF-α;(4)測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性;(5)TUNEL法檢測肺細(xì)胞的凋亡;(6)real-time PCR檢測大鼠的肺組織中PTX3基因mRNA的表達(dá)水平;(7)免疫組化法檢測肺組織PTX3蛋白的表達(dá);(8)Western Blot檢測肺組織PTX3蛋白的含量。 結(jié)果(一)PV組與C組相比,肺損傷各項指標(biāo)無顯著改變。HV組通氣4h PaO2顯著降低(P 0.05),肺組織LPI、W/D和MPO活性均顯著增加(P 0.05),組織病理學(xué)檢測表現(xiàn)急性炎性損傷性改變。HV組大鼠肺組織勻漿和肺泡灌洗液中TNF-α含量顯著大于C組和PV組(P 0.01),而C組與PV組無顯著差異(P 0.05)。TUNEL法檢測可見肺細(xì)胞凋亡改變。(二)與C組相比,HV組通氣4h后PTX3基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分別增加3.493倍和3.799倍;而PV組PTX3基因mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著改變(P0.05)。 結(jié)論大潮氣量機(jī)械通氣能導(dǎo)致肺損傷,而且顯著上調(diào)了PTX3基因mRNA和蛋白表達(dá)水平,這可能與VILI的發(fā)生密切相關(guān)。
【圖文】：

圖1. VILI 的可能機(jī)制機(jī)械性損傷和生物學(xué)損傷是相互聯(lián)系的，機(jī)械性損傷可以造成生物學(xué)損傷，生物學(xué)損傷也可以加重機(jī)械性損傷。生物體內(nèi)眾多細(xì)胞長期經(jīng)受著機(jī)械力的刺激，比如肺細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞等等。正常的機(jī)械刺激對于細(xì)胞的功能維持以及器官的發(fā)育是必不可少的，比如正常呼吸時肺細(xì)胞受到的伸縮刺激對于胎兒肺細(xì)胞的正常分化成熟是必需的，然而過度或不恰當(dāng)?shù)臋C(jī)械力刺激導(dǎo)致生物學(xué)損傷。而機(jī)械力究竟是如何轉(zhuǎn)化為細(xì)胞乃至生物體的生物學(xué)信號一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究[5]認(rèn)為機(jī)械牽張刺激可以通過細(xì)胞膜整合素受體與胞外基質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞膜陽離子通道改變以及較為經(jīng)典的 MAPK 通路(P38、ERK1/2、JNK、ERK5)等信號通路介導(dǎo)肺損傷的發(fā)生。Waters[13]報道牽張刺激可以激活陽離子通道并調(diào)節(jié) Na+-K+-ATPase活性,后者在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)水平衡起重要作用。另有研究證實細(xì)胞骨架的連接和構(gòu)成為機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生物學(xué)反應(yīng)提供生理學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞表面粘合蛋白、整合素、細(xì)胞骨架、

圖 3 VILI 時機(jī)械力轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號的可能機(jī)制PTX3 是一種急性期反應(yīng)蛋白，與急性期反應(yīng)蛋白（CRP）和血清淀粉樣蛋白（SAP）同屬 PTX 家族，，其基因近端啟動子區(qū)含有 Pu1, AP-1, NF-κB, Sp1 和 NFIL-6 結(jié)合位點(diǎn)。PTX3 基因序列分析提示，其啟動子中含有牽張反應(yīng)元件，并有研究已經(jīng)證實它們參與了機(jī)械牽張刺激引起的炎癥反應(yīng)過程，我們推測它們可能屬于牽張敏感基因，于上游啟動水平參與了 VILI 的發(fā)病。PTX3 是一種新發(fā)現(xiàn)的由感染和炎癥部位組織細(xì)胞分泌的炎癥標(biāo)志物，多種組織細(xì)胞在炎性刺激下能表達(dá) PTX3 ，包括骨髓源性樹突細(xì)胞（DC）、內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，還包括上皮細(xì)胞，比如腎上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞[17]。這暗示著 PTX3 在感染和炎癥部位具有放大先天性防御功能[18]。正常人血中 PTX3 水平較低，在炎癥和感染情況下迅速
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8

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本文編號：2655004