神經生長因子啟動哮喘腎上腺髓質細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙及蛋白質組學初步研究

發(fā)布時間：2020-05-05 17:00

【摘要】： 背景支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，其炎癥發(fā)生與調控氣道的神經系統(tǒng)之間存在復雜的相互作用。近年來，眾多的實驗證明哮喘狀態(tài)下神經生長因子(nerve growth factor，NGF)明顯增高，我們前期的研究也發(fā)現支氣管哮喘大鼠神經生長因子及其受體表達升高，因此，學術界越來越關注氣道神經源性炎癥在哮喘發(fā)病中的作用。有研究提示哮喘狀態(tài)下腎上腺髓質嗜鉻細胞可能存在腎上腺素的合成和(或)釋放障礙，同時外源性NGF可以使腎上腺髓質嗜鉻細胞向神經元方向轉化，那么哮喘狀態(tài)下血清中增高的NGF是否對腎上腺髓質嗜鉻細胞產生形態(tài)上的影響并進而導致其內分泌功能的下降?以及具體的機制如何?近來細胞冗余性概念的提出為腎上腺髓質嗜鉻細胞分化障礙提供了可能的理論支撐點。冗余性是指細胞除了必備的功能外還具有“多于必須”的功能，所謂的細胞可塑性也就是指冗余性在細胞表型上的轉分化表現。在非生理情況下，細胞的冗余性功能可能啟動，導致其專職功能下降或消失，而其兼職功能加強。本研究分別通過體內和體外實驗探討哮喘狀態(tài)下腎上腺素釋放障礙的可能原因，并通過蛋白質組學方法分離和鑒定其中起關鍵作用的蛋白質。第一章支氣管哮喘大鼠腎上腺髓質細胞表型改變與NGF表達水平初探目的觀察支氣管哮喘狀態(tài)下大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞(AMCC)形態(tài)學的改變以及NGF在腎上腺髓質嗜鉻細胞中的表達。方法利用光鏡觀察哮喘大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞的形態(tài)學變化，免疫組織化學結合顯微圖象分析觀察哮喘大鼠髓質嗜鉻細胞中NGF的表達變化。結果HE染色光鏡下觀察都可以見到腎上腺髓質嗜鉻細胞不同程度的空泡變性樣改變，脂質增多，少數可見纖維樣物質伸向皮質。與正常對照組(112.23±2.51)相比，哮喘組(121.79±3.24)大鼠NGF免疫陽性反應在腎上腺髓質嗜鉻細胞明顯上調(P＜0.05)。結論支氣管哮喘時腎上腺髓質嗜鉻細胞NGF的表達增高并出現形態(tài)學的改變，可能導致腎上腺素合成與釋放不足而參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。第二章神經生長因子啟動哮喘大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙目的探討支氣管哮喘(簡稱哮喘)狀態(tài)下腎上腺髓質嗜鉻細胞釋放腎上腺素不足的可能原因，明確神經生長因子(NGF)在哮喘發(fā)病機制中的作用。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為對照組、哮喘組、NGF干預組、抗NGF抗體干預組、SP組，每組8只，分別干預各組大鼠。電鏡觀察腎上腺髓質嗜鉻細胞超微結構的改變，免疫組織化學結合顯微圖像分析各組大鼠髓質嗜鉻細胞中苯乙醇胺N-甲基轉移酶(PNMT)的表達變化，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組大鼠血清中腎上腺素和去甲腎上腺素的變化。結果電鏡觀察可見：(1)哮喘組、NGF組和抗NGF抗體干預組大鼠腎上腺髓質細胞線粒體增多，并且嗜鉻顆粒減少；(2) NGF組腎上腺髓質嗜鉻細胞膜可見杵狀和絨毛狀突起。圖像分析結果顯示NGF組PNMT平均灰度值(A)為218±38，與對照組(182±25)、哮喘組(198±33)、抗NGF組(195±41)和SP組(195.46±39.82)比較差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為23.42、19.76、17.93、18.21，，P均＜0.05)；ELISA結果顯示NGF組血清腎上腺素濃度為(2.9±0.5)ng／ml、與對照組[(7.1±0.4) ng／ml]、哮喘組[(5.9±1.7)ng／ml]、抗NGF組[(5.7±0.6)ng／ml]和SP組[(5.91±1.58)ng／ml]比較差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為7.64、5.41、4.96、5.12 P均＜0.01)，哮喘組與對照組比較差異也有統(tǒng)計學意義(t=5.64，P＜0.01)，哮喘組和抗NGF組腎上腺素水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.87，P＞0.05)。結論NGF通過啟動腎上腺髓質嗜鉻細胞的功能冗余性使其表型和功能發(fā)生轉化，導致腎上腺素水平下降而參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展。第三章神經生長因子啟動原代培養(yǎng)的腎上腺髓質細胞功能冗余性致腎上腺素釋放障礙目的觀察NGF等對原代培養(yǎng)的腎上腺髓質嗜鉻細胞生物行為學的影響，探討可能的機制。方法采用單細胞消化法原代培養(yǎng)腎上腺髓質細胞，密度梯度離心和差速貼壁法分離和純化腎上腺髓質細胞。相差顯微鏡、電鏡觀察外源性NGF、SP作用下腎上腺髓質嗜鉻細胞形態(tài)和超微結構的改變，ELISA法檢測培養(yǎng)上清夜中腎上腺素和去甲腎上腺素濃度的變化。結果NGF干預后2天相差顯微鏡下可見腎上腺髓質細胞膜表面漸漸長出長絲狀突起。電鏡下NGF干預后可見腎上腺髓質嗜鉻細胞表面豐富的杵狀和絨毛狀突起，近細胞膜處可見小囊泡形成，細胞漿內線粒體豐富，結構較模糊，部分嵴丟失。ELISA檢測發(fā)現經NGF干預后培養(yǎng)上清液中腎上腺素濃度較正常組明顯降低(P＜0.05)，去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。SP干預后腎上腺素和去甲腎上腺素濃度沒有明顯改變。結論NGF通過啟動腎上腺髓質細胞功能冗余性使其表型和功能發(fā)生改變致腎上腺素合成和釋放障礙。第四章NGF啟動腎上腺髓質嗜鉻細胞冗余性的蛋白質組學初步研究目的初步明確NGF啟動腎上腺髓質嗜鉻細胞冗余性過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質，為支氣管哮喘的進一步的治療提供新的思路和可能的治療靶點。方法運用二維凝膠電泳、質譜分析法并結合生物信息學方法分離和鑒定NGF干預后的差異蛋白質。結果二維凝膠電泳獲取腎上腺髓質細胞正常組和NGF干預組的平均蛋白質點數為752±34和693±46，NGF干預組出現有意義的表達上調的點為48個，下調點為37個，隨機選取14個表達上調，6個表達下調的差異蛋白質點進行MOLDI-TOF質譜鑒定。質譜鑒定獲得了17張較好的肽質量指紋圖譜。本實驗通過Mascot軟件檢索MSDB數據庫和Profound軟件檢索MSDB數據庫初步鑒定17個可能與NGF啟動腎上腺髓質細胞冗余性致腎上腺素釋放障礙過程中相關的差異表達蛋白質，其中信號轉導蛋白Rho GDP dissociation inhibitor(GDI) alpha、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白(Peripherin intermediatefilament protein)可能在此過程發(fā)揮重要作用。結論RhoGDIα蛋白、分子伴侶蛋白HSP27、外周蛋白中間絲蛋白可能在NGF啟動腎上腺髓質嗜鉻細胞冗余性過程中發(fā)揮重要作用。
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