IDO基因修飾未成熟DC誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的實驗研究

發(fā)布時間：2020-05-05 14:36

【摘要】： 支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病,其發(fā)病機制尚未完全闡明�！癟h1/Th2偏移”假說被認為是哮喘發(fā)病的主要免疫學(xué)機制,該假說認為Th2細胞的過度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng),Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。正常人接觸過敏原后不會發(fā)生Th2細胞的過度活化,這是因為正常人可以對過敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過敏原后T細胞異常活化,增殖和分化為Th2細胞,引起“Th1/Th2偏移”,始動哮喘的氣道炎癥。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase ,IDO)是色氨酸分解代謝的限速酶,可形成局部低色氨酸環(huán)境[6],抑制活化的CD4~+T細胞增殖,誘導(dǎo)免疫耐受。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最強大的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell, APC),它既是氣道變應(yīng)性炎癥的始動因素,也可能是介導(dǎo)免疫耐受的樞紐環(huán)節(jié),在激發(fā)免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受兩方面均起關(guān)鍵作用[7-10]。本研究應(yīng)用pEGFP-N1-IDO基因真核表達載體轉(zhuǎn)染未成熟DC,并觀察IDO基因?qū)β训鞍字旅?激發(fā)小鼠模型CD4~+T細胞的影響;將pEGFP-N1-IDO基因真核表達載體轉(zhuǎn)染未成熟DC移入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道,觀察對其氣道炎癥的影響,為臨床防治哮喘提供新的思路。研究內(nèi)容和方法: 1.小鼠IDO基因的克隆及載體構(gòu)建:RT-PCR法擴增IDO cDNA全長基因序列,并將其克隆至真核表達載體pEGFP-N1上。 2.未成熟DC的分離、培養(yǎng)和鑒定:體外擴增小鼠骨髓來源的未成熟DC,采用光鏡、掃描電鏡、透射電鏡、流式細胞技術(shù)鑒定CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86分子。 3.小鼠IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因表達的鑒定:應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉(zhuǎn)染未成熟DC,轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,用RT-PCR、Western-blot法鑒定基因轉(zhuǎn)染未成熟DC中目的基因的mRNA和蛋白表達情況。 4. pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的影響。 5.建立卵蛋白(OVA)致敏/激發(fā)小鼠模型:腹腔注射OVA和霧化吸入OVA途徑來致敏/激發(fā)和激發(fā)小鼠,觀察BALF中細胞總數(shù)和EOS計數(shù)、BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平,病理切片觀察小鼠肺部氣道炎癥變化。 6. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC對卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+T細胞增殖、凋亡和分泌細胞因子的影響:分離卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+T細胞和正常小鼠脾臟CD4~+T細胞,分別與pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC共培養(yǎng)后,混合淋巴細胞反應(yīng)和TUNEL法檢測CD4~+T細胞增殖、凋亡情況,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的變化。 7. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC對卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥的影響:將IDO基因轉(zhuǎn)染的未成熟DC經(jīng)氣管注入卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi),病理切片觀察小鼠肺部氣道炎癥變化,進行BALF細胞總數(shù)和EOS計數(shù),ELISA檢測BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平。結(jié)果: 1.用RT-PCR法成功擴增出mIDO cDNA全長序列,并將其克隆至真核表達載體pEGFP-N1得pEGFP-N1-IDO,測序后序列完全正確。 2.獲得小鼠骨髓來源的未成熟DC。 3.應(yīng)用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉(zhuǎn)染未成熟DC后,pEGFP-N1-IDO轉(zhuǎn)染組和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,而對照組沒有綠色熒光,RT-PCR可檢測到相應(yīng)目的基因mRNA的表達,Western blot法可檢測到相應(yīng)目的蛋白的表達,而pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組和對照組不能檢測到IDO的mRNA和蛋白的表達。 4. pEGFP-N1-IDO真核表達載體轉(zhuǎn)染對未成熟DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的表達無影響,仍以未成熟型為主。 5.成功建立卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型,BALF中細胞總數(shù)和EOS計數(shù)增高、BALF中IL-4、IL-5的水平增高和IFN-γ水平降低,病理切片觀察卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型病理切片肺部氣道炎癥變化。 6. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹突細胞能抑制卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠模型CD4~+ T細胞增殖,pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4~+ T細胞減少,與和pEGFP- N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟樹突細胞可誘導(dǎo)CD4~+ T細胞凋亡,pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組CD4~+T細胞凋亡率為15.3%±2.6%,較對照組和pEGFP- N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組顯著增加(P0.01)。pEGFP-N1-IDO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5水平顯著降低,IFN-γ水平顯著升高。 7. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC能顯著地減輕卵蛋白致敏/激發(fā)小鼠氣道炎癥,減少BALF中細胞總數(shù)和EOS計數(shù)、降低BALF中IL-4、IL-5的水平和增高IFN-γ水平。結(jié)論: 1.成功構(gòu)建IDO基因高表達的未成熟DC細胞模型。 2. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在體外能誘導(dǎo)OVA致敏/激發(fā)小鼠脾臟CD4~+ T細胞呈低反應(yīng)性,能抑制OVA致敏/激發(fā)小鼠Th2細胞活化;IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC可誘導(dǎo)CD4~+ T細胞凋亡。 3. IDO基因轉(zhuǎn)染未成熟DC在OVA致敏/激發(fā)小鼠體內(nèi)能抑制其Th2細胞活化,改善變應(yīng)性氣道炎癥,提示IDO基因表達的上調(diào)可能成為誘導(dǎo)哮喘免疫耐受的作用和機制之一,為哮喘的治療提供了新的思路。
【圖文】：

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14圖 1-1-1 載體 pEGFP-Ｎ1 圖譜B/c 小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物所。要試劑：物 TaKaRa 公司日盒 Fermentas 公司立劑盒 Toyobo 公司日熱型 KODplusDNA 聚合酶 Toyobo 公司日試劑 TaKaRa 公司日重慶川東化工集團有限公司中重慶川東化工集團有限公司中膠回收試劑盒 BioFlux公司中

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