【摘要】：急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由多種病因引起的難以糾正的急性呼吸衰竭,病理表現(xiàn)為急性肺損傷。銅綠假單胞菌是重癥監(jiān)護病房(ICU)最常見的致病菌之一,肺內(nèi)感染銅綠假單胞菌可以引起直接性肺損傷。ARDS的治療一直是臨床救治的難點,目前主要還是依靠機械通氣(保護性肺通氣策略),其死亡率仍然高達40%以上。近年來,膽堿能抗炎通路(CAP)的激活被認(rèn)為可以抑制炎癥反應(yīng)、減輕肺損傷,甚至可以降低ARDS的死亡率,并已經(jīng)在部分動物模型上得到驗證。α7乙酰膽堿能受體(α7nAChR)是膽堿能抗炎通路的關(guān)鍵一環(huán),它是配體門控離子通道蛋白,廣泛分布與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),在神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中表達,參與各種生理反應(yīng)。α7nAChR激動劑可以激活膽堿能通路,也是目前研究膽堿能抗炎通路的主要靶點之一。GTS-21是一種選擇性α7nAChR激動劑,可以激活效應(yīng)細(xì)胞上的α7nAChR,影響細(xì)胞的功能,發(fā)揮調(diào)控炎癥作用。研究目的α7nAChR激動劑減輕肺損傷的機制并不完全清楚,特別是對于臨床比較常見的由銅綠假單胞菌引起的細(xì)菌性肺炎,繼而導(dǎo)致的直接肺損傷模型,目前尚未見報道。本研究通過氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌肺炎肺損傷模型,應(yīng)用GTS-21,研究α7nAChR激活對肺損傷的影響,并結(jié)合體外細(xì)胞實驗,在組織學(xué)和分子水平上檢測對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的作用,并探討其可能的機制。研究方法一建立肺炎肺損傷模型。C57BL/6野生型小鼠,鼠齡8-12周,體重22-26g,共30只,隨機分為3組:Control組(n=10):正常對照組,未經(jīng)任何處理;Sham組(n=10):假手術(shù)組,氣管內(nèi)注入無菌生理鹽水;Pneumonia(n=10):肺炎組,氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,建立肺炎模型。建立模型后,觀察各組小鼠一般狀態(tài),通過體外活體成像,觀察小鼠肺內(nèi)銅綠假單胞菌生長等指標(biāo)進一步確認(rèn)肺炎模型。肺損傷評估。觀察24小時后,處死小鼠,分別留取新鮮肺組織、肺泡灌洗液(BALF),通過測定BALF中心粒細(xì)胞數(shù)量,對肺組織切片染色進行肺組織損傷評分、測定肺W/D(濕/干重比)等方法評估肺損傷嚴(yán)重程度。在Sham組和肺炎組,我們還測定了肺泡灌洗液和肺勻漿中炎癥因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的水平二、觀察α7nAChR激動劑GTS-21對肺損傷的作用。1、研究α7nAChR激動劑GTS-21對野生型小鼠肺損傷后生存率的影響。C57BL/6野生型小鼠(32只,共4組,每組8只),分別隨機分為Sham組:假手術(shù)組;肺損傷組:氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,建立肺炎模型組;肺損傷+GTS-21組:氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,建立肺炎肺損傷模型,并在注入細(xì)菌前2小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg)1次,術(shù)后每8小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg);GTS-21組:假手術(shù)組+術(shù)前2小時和術(shù)后每8小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg)。觀察小鼠生存率。2、研究α7nAChR基因敲除小鼠和野生型小鼠肺損傷后生存率的影響。野生型和基因敲除小鼠各16只,各分成2組:Sham組(n=8只):假手術(shù)組;肺損傷組(n=8只):氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,造成肺炎肺損傷;觀察小鼠生存率。3、研究α7nAChR激動劑GTS-21對小鼠肺損傷后對相應(yīng)的組織細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)指標(biāo)的影響。C57BL/6野生型小鼠(40只,每組10只)和α7nAChR基因敲除小鼠(α7nAChR-/-)(40只,每組10只),分別隨機分為Sham組:假手術(shù)組;肺損傷組:氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,建立肺炎肺損傷模型組;肺損傷+GTS-21組:氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌,建立肺炎肺損傷模型,并在注入細(xì)菌前2小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg)1次,術(shù)后每8小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg);GTS-21組:假手術(shù)組+術(shù)前2小時和術(shù)后每8小時腹腔注射GTS-21(4mg/kg)。在觀察24小時后,處死小鼠。檢測指標(biāo):1)留取肺泡灌洗液(BALF),離心甩片后觀察中心粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量,檢測BALF中炎癥因子HMGB1水平;2)留取肺組織經(jīng)10%福爾馬林固定后,包埋切片HE染色,進行肺組織損傷評分比較肺損傷嚴(yán)重程度;3)留取新鮮肺組織,檢測其中 HMGB1、p65 NF-Kb,p-κb-α,MAPK p-p38,caspase-3,bcl-2 等蛋白表達。三、GTS-21對TNF-α誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用及其機制。應(yīng)用Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(A549)和TNF-α建立細(xì)胞炎癥模型。培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,在含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液1640中,在37℃,5%C02飽和度條件下,正常經(jīng)孵育傳代3次以上。隨機分為4組:正常對照組(Control):正常培養(yǎng),不加TNF-α和GTS-21;炎癥損傷組:以TNF-α(10ng/ml)刺激細(xì)胞,不加GTS-21;炎性損傷+GTS-21組:以TNF-α(10ng/ml)刺激細(xì)胞,4小時后予以 GTS-21(75uM);GTS-21 組:僅給予 GTS-21(75uM)。為進一步確認(rèn)p-p38通路在其中的作用,我們還使用了 p-p38激動劑和α7nAChR受體拮抗劑(α-Bungarotoxin,α-BTx)。所有組細(xì)胞均孵育12小時。檢測指標(biāo):1)MTT測定細(xì)胞活性;2)收集細(xì)胞培養(yǎng)液,采用ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1、IL-6變化;RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白,采用Western Blot方法測定細(xì)胞裂解液中p65 NF-κb,p-iκb-α,MAPK p-p3 8 等蛋白表達;3)采用TUNEL方法測定上皮細(xì)胞凋亡。四、統(tǒng)計方法。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x土SD)的形式,采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件和GraphPad Prism繪圖軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布,兩組之間采用獨立樣本t檢驗,多組之間采用方差分析。如果方差分析結(jié)果有顯著差異,再兩兩之間進行Newman-Keuls post hoc分析。當(dāng)P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著差異,當(dāng)P0.01認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)非常顯著差異。研究結(jié)果一、肺損傷模型的建立:氣管內(nèi)注入銅綠假單胞菌后,Control組和Sham組小鼠毛色和飲食正常;而肺損傷組小鼠精神萎靡,進食及飲水明顯減少,活動遲緩,體溫下降。在肺損傷組,24小時后均可經(jīng)Living Image系統(tǒng)觀察到細(xì)菌在小鼠肺內(nèi)成像。Control組和Sham組未見細(xì)菌生長,二者在BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量、肺損傷評分、肺W/D均無明顯差別。與Sham組比較,肺損傷組小鼠:1)BALF里中粒細(xì)胞大量聚集,數(shù)量較Sham組明顯增加(P0.01),炎癥因子HMGB1較Sham組升高(P0.05);2)肺損傷組肺組織中HMGB1蛋白表達明顯升高(P0.05);3)肺損傷組肺損傷指數(shù)明顯升高(P0.05)。二、GTS-21對肺損傷的影響1、在WT小鼠中,和肺損傷組比較,肺損傷+GTS-21組小鼠生存率明顯提高(P0.05);2、和WT小鼠比較,α7nAChR基因敲除小鼠肺損傷后生存率明顯下降(P0.05)。3、在WT小鼠中,與肺損傷組比較,肺損傷+GTS-21組小鼠BALF里中粒細(xì)胞數(shù)量較肺損傷組較少(P0.05),肺損傷指數(shù)降低(P0.05);與肺損傷組比較,肺損傷+GTS-21組小鼠BALF中炎癥因子HMGB1水平明顯下降,肺組織中HMGB1蛋白表達也低于肺損傷組(P0.05);Western Blot結(jié)果表明:與Sham組比較,肺損傷組肺組織p65 NF-Kb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表達明顯增加(P0.05),bcl-2表達下降(P0.01);而肺損傷+GTS-21組小鼠與肺損傷組比較,肺組織中p65 NF-κb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表達明顯下降(P0.05),bcl-2 表達升高(P0.01);在α7nAChRKO小鼠,與肺損傷組比較,肺損傷+GTS-21組小鼠BALF里中粒細(xì)胞聚集沒有明顯減少(P0.05),肺損傷指數(shù)沒有明顯改善(P0.05);并且,與WT小鼠比較,α7nAChRKO小鼠肺損傷后肺泡腔內(nèi)中粒細(xì)胞聚集、肺損傷指數(shù)明顯升高(P0.05);與WT小鼠損傷組比較,α7nAChR KO小鼠肺損傷組p65 NF-Kb,p-iκb-α,MAPK p-p38,caspase-3,表達明顯升高(P0.05)。三、細(xì)胞實驗結(jié)果與Control組比較,炎性損傷組MTT結(jié)果細(xì)胞活力下降(P0.05);而炎性損傷+GTS-21組,MTT結(jié)果細(xì)胞活力較炎性損傷組明顯提高(P0.05)。ELISA結(jié)果提示與Control組比較,炎性損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1和IL-6明顯升高(P0.05);而炎性損傷+GTS-21組,HMGB1和IL-6水平較炎性損傷組明顯下降(P0.05)。Western Blot結(jié)果也提示與與Control組比較,炎性損傷組p65 NF-Kb,p-iKb-α,MAPK p-p38 蛋白表達增加;炎性損傷+GTS-21 組,p65 NF-Kb,p-κb-α,MAPK p-p38較炎性損傷組明顯下降(P0.05)。TUNEL測定結(jié)果表明與Control組比較,炎性損傷組細(xì)胞凋亡增加(P0.05);與炎性損傷組比較,包括TNF-α10ng/ml和TNF-α 20ng/ml,炎性損傷+GTS-21組細(xì)胞凋亡都明顯減少(P0.05)。研究結(jié)論α7nAChR激動劑GTS-21可以改善因銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的急性肺損傷,提高生存率。其機制與通過抑制NF-Kb通路減輕炎癥反應(yīng),抑制MAPK p-p38通路活性,減少Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【圖文】：

逡逑粒細(xì)胞（圖２左）。逡逑Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｉｎ邋ＢＡＬＦ邋Ｌｕｎｇ邋ｉｎｊｕｒｙ邋ｓｃｏｒｅ逡逑Ｃ0ｎ，ｏ，邋；邐＇邋＇逡逑－＊邐＂邋－邋；逡逑．？邋？邋？逡逑＿邋＿＿逡逑灥~栧義希福埃埃�？＊辶x希靛危危卞，

本文編號：2605359