【摘要】：研究背景及目的急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一組由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、誤吸等非心源性因素引起的以進行性呼吸困難及頑固性低氧血癥為臨床表現(xiàn)的臨床綜合征,是呼吸科常見的急危重癥,近十年來,其60天死亡率一直高達25%以上[2]。目前的研究表明其病理生理過程主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生失控的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[3],通透性增加,進而出現(xiàn)彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫。在細(xì)胞或組織損傷過程中,炎癥與氧化應(yīng)激是機體防御反應(yīng)的重要組成部分,并且相互影響。炎癥反應(yīng)往往伴隨氧自由基的生成,進而清除病原微生物,而氧自由基也可作為第二信使調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為肺泡上皮細(xì)胞的“干細(xì)胞”,具有增殖和分泌的功能,在肺部炎癥及氧化應(yīng)激過程中起重要作用,產(chǎn)生大量的促炎因子,如IL-8、TGF-β和TNF-α等[3]促發(fā)“瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)”。其中,TNF-α是肺部炎癥及氧化應(yīng)激過程的主要促炎因子,在整個病理生理過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生具有破壞病原微生物及第二信使功能的活性氧(reactive oxygen species,ROS), ROS進一步促進TNF-α的釋放,如此不斷正反饋,進而觸發(fā)并放大下游一系列炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng),氧化肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞其細(xì)胞生理功能而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死。本實驗室前期研究表明,使用TNF受體-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)能有效下調(diào)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激,從而減輕急性肺損傷小鼠的肺組織破壞[5]及細(xì)胞凋亡[6][9]。因此,研究肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)對繼發(fā)的氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控作用,對于研究ARDS的病理生理學(xué)基礎(chǔ)具有重要指導(dǎo)意義。在肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激過程中,NADPH氧化酶(Nox)家族是產(chǎn)生ROS的重要來源,由Noxl-5及Duox1-2等亞型組成,各亞型的分布具有組織特異性,其中肺泡上皮細(xì)胞主要表達Noxl,劉珍[8]等人證明在TNF-α刺激下,A549細(xì)胞Noxl基因表達明顯上調(diào)。所以,在肺泡上皮細(xì)胞研究Nox1基因的表達,對于進一步研究肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激環(huán)路具有重要意義。本實驗室前期研究表明,TNFR-Fc可通過降低LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中TNF-α濃度,控制TNF-a對炎癥氧化應(yīng)激的活化作用,并下調(diào)Nox1、Nox2、Nox4及XO等基因表達,減輕組織氧化損傷[9]。TNF-α刺激A549細(xì)胞可成功模擬體外肺泡上皮細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激模型,且沉默NF-κB p65基因可下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及凋亡水平,且進一步研究表明,NF-K Bp65可結(jié)合至Nox1啟動子片段,說明NF-K B p65對Nox1啟動子具有調(diào)控作用。除NF-κB外,是否還有其他轉(zhuǎn)錄因子參與了ARDS過程中TNF-α對氧化相關(guān)基因Noxl的調(diào)控,從而啟動了炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷過程,目前尚無明確定論。鑒此,我們從Nox1基因啟動表達的開始環(huán)節(jié)——啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對Nox1基因的表達進行研究。啟動子(promoter)是RNA酶辨認(rèn)、結(jié)合和啟動下游基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列,控制著基因的轉(zhuǎn)錄和表達強度。對于真核生物,啟動子本身并不直接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,而是通過與具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)結(jié)合才能調(diào)控下游基因活動。故研究與啟動子DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),是了解目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的重要切入點。 Lambeth等研究表明Nox1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游4000余堿基的序列中包含IRSE、GAS、kappa B、GATA、C/ERB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,上述轉(zhuǎn)錄因子對Nox1轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用。因此,在炎癥氧化應(yīng)激細(xì)胞模型上研究Noxl啟動子區(qū)的差異結(jié)合蛋白對研究Nox1通路的活化具有重要意義。目前對啟動子結(jié)合蛋白的研究方法分為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外方法。細(xì)胞內(nèi)方法包括酵母單雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)等,是用已知的啟動子序列篩選與其結(jié)合的蛋白編碼基因,再通過生物信息學(xué)確定該蛋白質(zhì),具有可高通量篩選的特點,但特異性不高。細(xì)胞外方法包括凝膠阻滯實驗、DNase I足跡試驗等,是在體外用已重組構(gòu)建好的蛋白質(zhì)與啟動子結(jié)合而驗證該蛋白,特異性高,但效率低,操作復(fù)雜。鑒于目前對啟動子結(jié)合蛋白研究方法所存在的問題,需要采用高通量及特異性高的方法進行Nox1啟動子區(qū)差異結(jié)合蛋白的篩選,進一步闡明ARDS的病理生理機制。我們采用了生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)、雙向熒光差異蛋白凝膠電泳和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù),對TNF-α刺激A549建立的細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激模型Nox1啟動子區(qū)的差異結(jié)合蛋白進行篩選及鑒定,為后續(xù)研究Nox1轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供實驗基礎(chǔ),并對篩選出的蛋白質(zhì)選擇性進行初步的功能研究。研究方法：1.TNF-α刺激A549細(xì)胞Noxl啟動子區(qū)差異結(jié)合蛋白的篩選1.1制備生物素標(biāo)記Nox1啟動子DNA探針本實驗室保留的PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒大腸桿菌菌種擴大培養(yǎng)后按說明書提取PGL3-Basic-Nox1重組質(zhì)粒作為模板,生物素標(biāo)記Nox1啟動子上游引物5’端,PCR擴增末端帶生物素的Noxl啟動子探針,PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳,按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作說明切膠回收Nox1啟動子DNA探針。1.2 DNA pull-down實驗將A549細(xì)胞以1.5×106接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,待貼壁細(xì)胞融合至80%時更換為無血清培養(yǎng)基12h后,實驗組細(xì)胞給予含TNF-α (10ng/ml)的無血清培養(yǎng)基、對照組給予等量無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),刺激1h后收集細(xì)胞沉淀按照胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒說明書進行胞漿胞核蛋白抽提,按EttanTM 2D Quant Kit說明書測定核蛋白濃度。將兩組核蛋白按Dynabeads(?) kilobase BINDERTM Kit說明書進行DNA pull-down實驗,將細(xì)胞核蛋白Nox1啟動子區(qū)結(jié)合蛋白洗脫。1.3雙向熒光差異蛋白凝膠電泳(差異蛋白DIGE分離)細(xì)胞核蛋白進行熒光染料CyDye標(biāo)記,上樣到24cm pH 3-10 NL IPG干膠條,置入EttanTM IPGPhor進行第一向電泳后,取出IPG干膠條,平衡液平衡后放置于12.5%的聚丙烯酰胺凝膠上端,低熔點瓊脂糖凝膠封膠后用EttanTM DALT Six電泳儀避光條件下進行恒定功率第二向電泳。上述用CyDye染色的凝膠為分析膠。用Typhoon Imager 9400成像儀對電泳后膠板圖像掃描及成像,通過ImageQuant TL軟件可以看到Cy2、Cy3以及Cy5的圖像分別為藍色、綠色及紅色,分別代表內(nèi)標(biāo)蛋白、對照組Nox1啟動子結(jié)合蛋白和刺激組Nox1啟動子結(jié)合蛋白,Cy3和Cy5通道圖像疊加后得到Overlay圖像。1.4制備膠的制作、成像及差異蛋白分析、挖膠含有同等量各組樣品蛋白混合后的樣品加樣到制備膠進行一向和二向電泳,具體步驟和參數(shù)與分析膠的制備要求相同。電泳結(jié)束后,固定、考馬斯亮藍G250染色液染色,Image Scanner對膠圖進行掃描,得到制備膠的膠圖。用DeCyder V6.5分析軟件在分析膠中先進行膠內(nèi)差異分析,再進行膠間差異分析,最后過濾平均體積差異大于1.5倍的蛋白點,對分析到的差異點在制備膠上匹配到相對應(yīng)的蛋白點,最后利用EttanTM Spot picker全自動斑點切取系統(tǒng)進行挖膠。2.TNF-α刺激A549細(xì)胞Nox1啟動子差異結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析2.1質(zhì)譜分析將差異蛋白點經(jīng)胰酶消化等多步質(zhì)譜鑒定前樣品處理后,樣品點靶輸入ABI 4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀中,獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF),采用MS和MS/MS聯(lián)合模式搜索數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot,搜索物種為人。對結(jié)果按Mascot得分、匹配的片段數(shù)和覆蓋率等進行綜合判定。2.2生物信息學(xué)分析采用WoLF PSORT預(yù)測軟件及參考Swiss-Prot及NCBI,對DIGE所篩選出的TNF-α刺激A549細(xì)胞Nox1啟動子差異結(jié)合蛋白進行綜合的亞細(xì)胞定位分析預(yù)測。應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫對所鑒定出來的差異蛋白進行蛋白質(zhì)一級相互作用預(yù)測。3. CSRP2對Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA載體的構(gòu)建體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,提取總RNA, RT-PCR擴增CSRP2基因mRNACDS全長片段,通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建pcDNA3-CSRP2-HA載體。3.2細(xì)胞免疫熒光檢測CSRP2細(xì)胞內(nèi)定位A549細(xì)胞以1×105接種于24孔板,待長至80%融合時按Lipofectamine2000說明書進行pcDNA3-CSRP2-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,同時進行陰性對照轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染24h后給TNF-α刺激組以終濃度為lOng/ml的TNF-α培養(yǎng)基500 ul,對照組加入等量普通培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1h后進行免疫熒光染色,檢測細(xì)胞免疫熒光。3.3熒光素酶報告基因檢測CSRP2對Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響細(xì)胞培養(yǎng)同步驟3.2,待長至80%融合時按Lipofectamine 2000說明書進行pcDNA3-CSRP2-HA質(zhì)粒、PGL3-Basic-Noxl質(zhì)粒(實驗室前期構(gòu)建)共轉(zhuǎn)染,同時進行陰性對照；轉(zhuǎn)染24h后給TNF-α刺激組以終濃度為10ng/m 1的TNF-α培養(yǎng)基500 ul,對照組加入等量普通培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)20h后檢測熒光素酶活性。結(jié)果1. TNF-α刺激A549細(xì)胞Noxl啟動子差異結(jié)合蛋白的篩選制備膠與分離膠蛋白質(zhì)點匹配后,通過軟件分析找到感興趣的差異蛋白點(表達差異大于1.5倍)共24個,其中上調(diào)點23個,下調(diào)點1個。2. TNF-a刺激A549細(xì)胞Nox1啟動子差異結(jié)合蛋白的質(zhì)譜鑒定2.1 質(zhì)譜鑒定通過質(zhì)譜鑒定,從24個差異蛋白點中鑒定出13種蛋白質(zhì),分別為GLE1、 ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、GATC、 SSX11、H4、CSRP2,其中,KRT1和KRT10為同類蛋白質(zhì)(角蛋白),膠粒724、725、727、742鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)KRT9,膠粒728、741、745、754鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)KRT10,膠粒1556、1591鑒定結(jié)果為蛋白質(zhì)GSTM5,說明這些蛋白質(zhì)在TNF-α刺激后發(fā)生了修飾的改變。2.2蛋白質(zhì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析通過軟件及數(shù)據(jù)庫預(yù)測,鑒定出的13種蛋白質(zhì)中,GLE1、EXD2、KRT9、 TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GATC、Histone H4、CSRP2具有核定位信號。2.3蛋白質(zhì)一級相互作用分析通過軟件分析, KRT1、KRT9、ALB及 Histone H4之間存在相互作用關(guān)系,KRT10與GLE1之間存在相互關(guān)系。3. CSRP2對Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA載體的構(gòu)建通過測序鑒定, 證明pcDNA3-CSRP2-HA載體構(gòu)建成功。3.2細(xì)胞免疫熒光檢測CSRP2細(xì)胞內(nèi)核定位靜息狀態(tài)下,CRP2在胞漿及胞核,但主要在細(xì)胞漿內(nèi)分布,TNF-α刺激1h后,CSRP2濃聚于核膜,部分入核。3.3熒光素酶報告基因檢測CSRP2對Nox1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響經(jīng)單因素方差分析,靜息狀態(tài)下,pcDNA3-CSRP2-C-HA轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著高于pcDNA3-C-HA轉(zhuǎn)染組(F=21.114, P=0.006),經(jīng)析因分析,TNF-α刺激后,熒光素酶活性顯著升高(F=46.189, P=0.000); pcDNA3-CSRP2-HA轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著高于pcDNA3-HA轉(zhuǎn)染組(F=26.868, P=0.000); TNF-α與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種處理因素間有交互效應(yīng)(F=5.447, P=0.042).結(jié)論1. GLE1、ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、 GATC、SSX11、H4、CSRP2等13種差異蛋白質(zhì)可能直接／間接參與了]TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞Nox1啟動子轉(zhuǎn)錄活化過程；2.初步證明CSRP2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,在TNF-α刺激下發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從胞漿進入胞核,并參與了Nox1基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R563.8

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本文編號：2177516