本文選題：N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸　切入點(diǎn)：肌成纖維細(xì)胞　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：矽肺是由于在職業(yè)活動(dòng)中長(zhǎng)期吸入二氧化硅(Si O2)粉塵引起,其基本病理特征包括矽結(jié)節(jié)的形成和肺組織纖維化�，F(xiàn)有研究顯示,肺組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。作為RAS的關(guān)鍵酶,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)含有N端和C端兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域。其中C端結(jié)構(gòu)域能夠催化血管緊張素I(angiotensin I,Ang I)轉(zhuǎn)化為血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)。而Ang II是RAS致纖維化效應(yīng)重要的活性蛋白,其作用主要由血管緊張素II的1型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)介導(dǎo),包括誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。ACE N端結(jié)構(gòu)域可特異性水解抗纖維化短肽N-乙�；�-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP),在ACE N端催化結(jié)構(gòu)域缺陷的小鼠體內(nèi)Ac-SDKP含量明顯上調(diào),發(fā)揮抗器官纖維化效應(yīng)。同樣,給予外源性Ac-SDKP,亦能夠降低ACE野生型鼠肺損傷和肺纖維化程度�？梢夾c-SDKP與RAS的交互作用,可能是其抗纖維化作用的重要分子機(jī)制之一。在本研究中,以Ang II信號(hào)在矽肺纖維化中的作用作為研究的切入點(diǎn),觀察Ac-SDKP能否通過抑制Ang II的作用調(diào)控矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),β2腎上腺素受體-激動(dòng)型G蛋白(β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein,ADRB2-Gs)復(fù)合物在矽肺模型中低表達(dá),而在Ac-SDKP抗纖維化治療組中表達(dá)顯著上調(diào),提示該蛋白是Ac-SDKP抗矽肺纖維化中的調(diào)控蛋白之一。ADRB2抗器官纖維化作用與其促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的合成有關(guān)。相關(guān)研究報(bào)道,c AMP信號(hào)和Ang II/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming gorwth factor-β1,TGF-β1)信號(hào)的交互作用在纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。c AMP信號(hào)能夠抑制Ang II/TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原合成。Ang II/TGF-β1則能夠通過上調(diào)磷酸二脂酶(phosphodiesterase,PDE)加速c AMP的水解。而Ac-SDKP對(duì)c AMP信號(hào)和Ang II信號(hào)的調(diào)控及Ac-SDKP能否通過c AMP信號(hào)調(diào)節(jié)Ang II信號(hào),目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。綜合以上研究,本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建矽肺動(dòng)物模型結(jié)合Ang II誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型,觀察Ac-SDKP與Ang II信號(hào)和c AMP信號(hào)的交互作用對(duì)矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響,并分析Ac-SDKP能否通過活化c AMP,促進(jìn)c AMP依賴性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號(hào)及其下游的c AMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB),從而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。以進(jìn)一步揭示矽肺發(fā)生、發(fā)展及Ac-SDKP保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。第一部分Ac-SDKP、Ang II信號(hào)和c AMP信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響目的:通過建立矽肺動(dòng)物模型,并體外觀察Ang II誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng),分析Ac-SDKP、ACE/Ang II/AT1R軸和c AMP信號(hào)的變化對(duì)矽肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。方法:1采用HOPE-MED8050動(dòng)式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型。染塵參數(shù):染毒室容積0.3m3,柜內(nèi)溫度20~25℃,濕度70%~75%,壓力-50Pa~+50Pa,氧氣濃度20%,Si O2粉塵進(jìn)入速度為3.0~3.5ml/min,柜內(nèi)粉塵質(zhì)量濃度2000 mg/m3,每只動(dòng)物每天染塵3h。3周齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,每組10只。分別染塵0周、2周、4周、8周、12周、16周,觀察大鼠矽肺形成的動(dòng)態(tài)變化。2觀察Ang II(10-7mol/L)誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)(0、5min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效應(yīng)。3采用HE染色、Masson染色法觀察肺組織病理形態(tài)的改變,分別采用免疫組織化學(xué)法、Western blot法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原、纖連蛋白(fibronectin,Fn)、波形蛋白(Vimentin)、Gαs、抑制型G蛋白(inhibitory G protein,Gαi2/3)、ACE及AT1R的蛋白表達(dá)及定位。采用酶免疫分析法(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)Ac-SDKP、Ang II和c AMP的含量。結(jié)果:1 HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁薄,無明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。染塵2周后,可見肺泡壁增寬并伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。矽肺模型4周組偶見孤立的細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成(主要由巨噬細(xì)胞構(gòu)成)。矽肺模型8周、12周組大鼠肺組織肺泡間隔增寬明顯,且細(xì)胞性結(jié)節(jié)數(shù)量增多。矽肺模型16周組肺組織內(nèi)可見多個(gè)細(xì)胞性結(jié)節(jié)的融合和間質(zhì)纖維化的形成,并可見細(xì)胞纖維性矽結(jié)節(jié)的形成。Masson染色顯示結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域出現(xiàn)藍(lán)紫色膠原沉積,并隨模型制備時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,至矽肺模型16周組最為顯著。2免疫組織化學(xué)染色顯示,在矽肺模型16周組,α-SMA標(biāo)記的肌成纖維細(xì)胞主要位于細(xì)胞性結(jié)節(jié)周邊及間質(zhì)纖維化病變區(qū)域。Vimentin陽性表達(dá)于細(xì)胞性結(jié)節(jié)區(qū)域。Western blot結(jié)果顯示,α-SMA、I型膠原、Fn、Vimentin的蛋白表達(dá)在矽肺模型4周、8周、12周、16周較對(duì)照組逐漸增多。3 Western blot及ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比在矽肺模型2周、4周、8周、12周、16周組,ACE、Ang II、AT1R的含量逐漸升高。肺組織Ac-SDKP的水平在矽肺模型2周組較對(duì)照組明顯升高,隨后在矽肺模型組4周、8周、12周、16周組含量逐漸降低。4 Western blot結(jié)果顯示,Gαi2/3的蛋白表達(dá)在矽肺模型4周、8周、12周、16周組與對(duì)照組比較逐漸增多。在矽肺模型8周組Gαs的蛋白表達(dá)及c AMP的含量較對(duì)照組開始出現(xiàn)明顯降低,至染塵16周達(dá)最低。5 Ang II能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。Gαs、c AMP的表達(dá)隨Ang II刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,而Gαi2/3的蛋白表達(dá)逐漸升高。第二部分Ac-SDKP活化c AMP/PKA信號(hào)抑制矽肺纖維化的作用及機(jī)制目的:分別給予矽肺大鼠Ac-SDKP和cAMP類似物db-cAMP抗纖維化治療及預(yù)防治療。體外采用Ang II誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并給予Ac-SDKP、db-c AMP及選擇性PKA阻斷劑H89的預(yù)處理,觀察c AMP/PKA信號(hào)活化在Ac-SDKP抑制矽肺纖維化中的作用。方法:1采用HOPE-MED8050動(dòng)式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺動(dòng)物模型,將動(dòng)物隨機(jī)分組:1)對(duì)照16周組;2)矽肺模型16周組;3)Ac-SDKP抗纖維化治療組;4)Ac-SDKP預(yù)防治療組;5)db-c AMP抗纖維化治療組;6)db-c AMP預(yù)防治療組。2原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組為:1)正常對(duì)照組;2)Ang II(10-7mol/L)誘導(dǎo)組;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)組;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)組;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)組;6)Ang II+db-c AMP+H89組。3采用Western blot、ELSIA法檢測(cè)體內(nèi)外α-SMA、I型膠原、Vimentin、Fn、ACE、Ang II、AT1R、Gαs、Gαi2/3、c AMP和PKA的蛋白表達(dá)。采用免疫熒光化學(xué)染色檢測(cè)矽肺組織α-SMA/Gαi3及成纖維細(xì)胞α-SMA/PKA的共表達(dá)。結(jié)果:1 Western blot結(jié)果顯示,與矽肺模型16周組比較,Ac-SDKP及db-c AMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組α-SMA、I型膠原、Fn和Vimentin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。2 Western blot結(jié)果顯示,Ac-SDKP、db-c AMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組,AT1R的蛋白表達(dá)較矽肺模型16周組明顯降低,ACE和Ang II的表達(dá)在Ac-SDKP和db-c AMP治療組下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3免疫熒光化學(xué)染色顯示,在矽肺模型16周組,纖維化病變區(qū)域有大量綠色熒光標(biāo)記的α-SMA陽性表達(dá)。Gαi3紅色熒光的表達(dá)亦顯著增加,采用兩種蛋白熒光組合定位技術(shù),可見α-SMA和Gαi3共表達(dá)于矽結(jié)節(jié)及間質(zhì)纖維化區(qū)域。Ac-SDKP、db-c AMP抗纖維化治療組和預(yù)防治療組,Gαi3與α-SMA的陽性表達(dá)降低。Western blot結(jié)果顯示,與矽肺模型16周組相比,在Ac-SDKP、db-c AMP治療組,Gαi2/3蛋白表達(dá)下降,Gαs、c AMP、PKA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。4免疫組織化學(xué)染色顯示,經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后,與對(duì)照組相比,胞漿內(nèi)有大量α-SMA陽性表達(dá)。給予Ac-SDKP和db-c AMP干預(yù)后,α-SMA陽表達(dá)明顯減弱。而H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-c AMP作用。Western blot結(jié)果顯示,Ac-SDKP、db-c AMP干預(yù)能明顯下調(diào)Ang II誘導(dǎo)的α-SMA、I型膠原和Fn的蛋白表達(dá)。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預(yù)組α-SMA、I型膠原、Fn的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。5 Western blot結(jié)果顯示,給以Ac-SDKP、db-c AMP預(yù)處理,Gαi2/3蛋白的表達(dá)均較Ang II誘導(dǎo)組下調(diào),Gαs的蛋白表達(dá)較Ang II誘導(dǎo)組上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預(yù)組Gαi2/3蛋白表達(dá)明顯升高,Gαs蛋白的表達(dá)明顯降低。6免疫熒光染色檢測(cè)α-SMA/PKA共表達(dá)結(jié)果顯示,對(duì)照組PKA蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中,胞漿中α-SMA纖維狀結(jié)構(gòu)呈微弱表達(dá)或無表達(dá)。經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后,與對(duì)照組相比,PKA蛋白陽性表達(dá)減弱,α-SMA陽性表達(dá)則明顯增強(qiáng)。給予Ac-SDKP和db-c AMP干預(yù)后,與Ang II組相比,PKA陽性表達(dá)明顯增強(qiáng),α-SMA陽性表達(dá)明顯降低。而H89阻斷了Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot結(jié)果顯示,予以Ac-SDKP、db-c AMP干預(yù)后,與Ang II組比較,c AMP、PKA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干預(yù)組c AMP、PKA蛋白表達(dá)下降。第三部分Ac-SDKP調(diào)節(jié)p CREB、p Smad2/3信號(hào)抑制矽肺纖維化的作用及機(jī)制目的:采用矽肺動(dòng)物模型及體外細(xì)胞培養(yǎng),觀察Ac-SDKP抑制矽肺纖維化的作用是否與調(diào)控p CREB、p Smad2/3信號(hào)有關(guān)。方法:1采用HOPE-MED8050動(dòng)式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型,動(dòng)物被隨機(jī)分為:1)對(duì)照16周組;2)矽肺模型16周組;3)Ac-SDKP抗纖維化治療組;4)Ac-SDKP預(yù)防治療組;5)db-c AMP抗纖維化治療組;6)db-c AMP預(yù)防治療組。2大鼠肺成纖維細(xì)胞分別給予以下處理:1)正常對(duì)照組;2)Ang II(10-7mol/L)誘導(dǎo)組;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)組;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)組;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)組;6)Ang II+db-c AMP+H89組。3采用Western blot檢測(cè)矽肺組織及成纖維細(xì)胞中p CREB、CREB、p Smad2/3和Smad2/3的蛋白表達(dá)。免疫熒光染色法檢測(cè)體內(nèi)外p CREB/α-SMA、p Smad2/3與α-SMA的共表達(dá),應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)觀察成纖維細(xì)胞核中p CREB、p Smad2/3與CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)的相互作用。結(jié)果:1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,p CREB在肺泡上皮細(xì)胞中陽性表達(dá)較為顯著,在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)減弱。而p Smad2/3在矽結(jié)節(jié)內(nèi)陽性表達(dá)顯著升高。免疫熒光化學(xué)染色顯示,在正常對(duì)照組中,可見紅色熒光標(biāo)記的p Smad2/3蛋白微弱表達(dá)于細(xì)胞核中,α-SMA蛋白綠色熒光主要表達(dá)于氣管平滑肌細(xì)胞。矽肺模型16周組,α-SMA蛋白主要表達(dá)于矽結(jié)節(jié)周圍及肺泡壁增寬區(qū)域,p Smad2/3蛋白亦在上述部位的細(xì)胞核中表達(dá)明顯增多,將兩種熒光標(biāo)記的蛋白圖像組合后發(fā)現(xiàn),纖維化病變區(qū)域的一些細(xì)胞胞漿內(nèi)既有α-SMA蛋白陽性表達(dá),又有細(xì)胞核中p Smad2/3蛋白的陽性表達(dá)。在Ac-SDKP及db-c AMP抗纖維化治療和預(yù)防治療組中,p Smad2/3蛋白和α-SMA蛋白陽性表達(dá)減弱。Western blot結(jié)果顯示,在矽肺模型16周組p CREB蛋白表達(dá)下調(diào),p Smad2/3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Ac-SDKP、db-c AMP治療組,促進(jìn)了p CREB蛋白表達(dá),抑制了p Smad2/3蛋白表達(dá)。CREB、Smad2/3的蛋白表達(dá)無明顯差異。2免疫熒光染色觀察α-SMA/p CREB的共定位表達(dá)結(jié)果顯示,在對(duì)照組,p CREB較多表達(dá)于細(xì)胞核,胞漿中亦有表達(dá),而α-SMA呈微弱表達(dá)或無表達(dá)。經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后,細(xì)胞中p CREB陽性表達(dá)顯著下降,α-SMA陽性表達(dá)則明顯增強(qiáng)。分別給予Ac-SDKP和db-c AMP干預(yù)后,細(xì)胞中α-SMA表達(dá)明顯減弱,p CREB陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)。H89能夠顯著抑制Ac-SDKP和db-c AMP的作用。免疫熒光染色結(jié)果還顯示,Ang II能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞核中p Smad2/3表達(dá)及細(xì)胞漿中α-SMA的表達(dá)。Ac-SDKP及db-c AMP預(yù)處理,降低了成纖維細(xì)胞中p Smad2/3和α-SMA的共表達(dá)。H89能夠顯著阻斷Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)Ang II誘導(dǎo)24h后,成纖維細(xì)胞p CREB的表達(dá)降低,p Smad2/3蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)。Ac-SDKP、db-c AMP預(yù)處理后明顯促進(jìn)了p CREB的表達(dá),降低了p Smad2/3的蛋白表達(dá)。H89預(yù)處理取消了Ac-SDKP、db-c AMP的上述作用。CREB、Smad2/3的蛋白表達(dá)無明顯差異。3成纖維細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)果顯示,CBP能夠分別與p Smad2/3和p CREB結(jié)合。在Ang II誘導(dǎo)組,p Smad2/3與CBP的結(jié)合上調(diào),而p CREB與CBP的結(jié)合降低。給予Ac-SDKP、db-c AMP預(yù)處理,促進(jìn)了p CREB與CBP的結(jié)合,降低了p Smad2/3與CBP的結(jié)合。結(jié)論:1矽肺組織局部ACE/Ang II/AT1R在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸升高,并且體外Ang II能夠刺激肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化;Ac-SDKP、c AMP的表達(dá)在矽肺發(fā)生、發(fā)展過程中呈下降趨勢(shì)。Ac-SDKP與c AMP信號(hào)和Ang II信號(hào)參與了大鼠矽肺纖維化過程。2在矽肺組織及Ang II誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中,Ac-SDKP可通過活化c AMP/PKA/p CREB信號(hào)抑制p Smad2/3的表達(dá),且Ac-SDKP可促進(jìn)p CREB/CBP復(fù)合物的形成,降低p Smad2/3與CBP的結(jié)合,抑制Smad信號(hào),發(fā)揮其抗矽肺纖維化的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R135.2

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