本文關(guān)鍵詞：廣州地區(qū)育齡期女性陰道菌群多樣性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：陰道菌群與宿主形成互惠關(guān)系,是女性多層面抵御病原菌入侵的重要組成部分,對(duì)機(jī)體的健康和疾病有著重大影響。近年來16S rRNA基因測(cè)序方法的應(yīng)用,使我們對(duì)陰道菌群結(jié)構(gòu)和組成的認(rèn)識(shí)顯著提高。在無癥狀或者健康女性陰道內(nèi)存在著幾種微生物群,多數(shù)以乳酸桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌,而其他的也由多種大量的厭氧微生物組成。陰道pH值與陰道菌群相關(guān),其可能指示了群落的表現(xiàn),低pH值(≤4.5)多被認(rèn)為“健康”的同義詞。對(duì)物種組成之間更深的認(rèn)識(shí)需要了解它們隨著時(shí)間的推移或?qū)C(jī)體環(huán)境改變?nèi)绾雾憫?yīng),月經(jīng)和諸如性交、沖洗及其他行為習(xí)慣等人類活動(dòng)對(duì)陰道生態(tài)系統(tǒng)造成的動(dòng)態(tài)變化,這也是對(duì)疾病診斷和評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)�；陉幍郎鷳B(tài)系統(tǒng)真正的功能而不只是其簡(jiǎn)單的組成,更好的理解其“正�！焙汀敖】怠�,將有助于更明確的界定健康,進(jìn)一步提高疾病的診斷和開發(fā)更個(gè)性化的治療方案,以更好的促進(jìn)健康和治療疾病�；诩�(xì)菌16S rRNA進(jìn)行測(cè)序的第二代高通量測(cè)序技術(shù),具有通量高,成本低廉的優(yōu)點(diǎn),能夠顯著改善傳統(tǒng)微生物研究方法的不足,獲得比較理想的微生物群落數(shù)據(jù),為我們研究微生物生態(tài)學(xué)奠定了良好的方法學(xué)基礎(chǔ)。本課題組建立了基于Illumina雙末端測(cè)序16S rRNA標(biāo)簽序列分析微生物群落的新方法,即BIPES,并建立了新的序列聚類工具TSC,操作簡(jiǎn)便、可定量定性。QIIME可以高效低成本地分析微生物群落。2008年,美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)資助1.57億美元投資人體微生物計(jì)劃(Human Microbiome Project, HMP),建立并不斷完善了微生物基因數(shù)據(jù)庫,也不斷揭示菌群與健康、疾病之間的關(guān)聯(lián)。但是種族、地理、文化、行為等因素均可導(dǎo)致人體陰道菌群結(jié)構(gòu)差異,而生活在中國廣州地區(qū)育齡期非孕婦人群陰道菌群分布特征、女性性工作者陰道菌群分布特征以及女性月經(jīng)周期陰道菌群動(dòng)態(tài)變化尚不明確。研究目的：1、闡述中國廣州地區(qū)育齡期一般女性人群的陰道菌群特征及陰道pH≤4.5和pH4.5中微生物群落的多樣性,通過分析pH≤4.5組和pH4.5組的α、β多樣性以及菌群構(gòu)成,用LEfSe在線工具尋找兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的taxa,進(jìn)一步展示一般女性陰道菌群多樣性。2、揭示特殊女性群體性工作者陰道菌群菌群特征,通過分析女性性工作者與一般女性人群陰道菌群的α、β多樣性以及菌群構(gòu)成,并用LEfSe尋找兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的taxa,比較女性性工作者與一般女性人群陰道菌群的差異。3、探究陰道菌群隨著月經(jīng)周期的改變是否相對(duì)穩(wěn)定。通過對(duì)月經(jīng)周期陰道菌群的α、β多樣性及和陰道菌群的穩(wěn)定性和彈性分析,探討隨著月經(jīng)周期改變陰道菌群的變化。研究方法：第一章2014年07月～2014年08月,招募在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康體檢中心進(jìn)行常規(guī)體檢的女性志愿者,在常規(guī)婦科體檢前,告知其研究方案及意義,得到其同意并配合進(jìn)行采樣及相關(guān)信息問卷。由經(jīng)驗(yàn)豐富的婦產(chǎn)科醫(yī)生,使用窺陰器撐開陰道,在肉眼直視下,使用一次性棉簽拭子,采集后穹窿部位陰道分泌物,同時(shí)采集三個(gè)平行樣品。按照入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn),共納入志愿者99人,年齡19-52歲。采集的樣品暫時(shí)存放于帶有冰盒生物樣品運(yùn)輸箱,在4小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱保存,直到提取樣品中細(xì)菌的總DNA。使用細(xì)菌16S通用引物,PCR擴(kuò)增陰道拭子樣品的16S rRNA V46保守區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行PE100-bp測(cè)序后,得到高通量下機(jī)原始數(shù)據(jù)序列,采用QIIME流程分析一般女性陰道菌群特征和pH_≤4.5組和pH4.5組不同pH的α、β多樣性和使用在線統(tǒng)計(jì)分析工具LEfSe尋找兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的taxa。生物信息學(xué)分析主要包括操作分類單元(Operational Taxonomy Units, OTU)的生成及主成分分析(Principal Coordinate Analysis, PCoA)、假設(shè)驗(yàn)證分析、進(jìn)化樹分析及菌群特征性分析、菌屬豐富度分析、群落結(jié)構(gòu)多樣性分析等。具體流程為使用BIPES進(jìn)行序列預(yù)處理,UEARCH去嵌合體,然后Uclust(USEARCH)做聚類,我們將UCLUST算法相似度參數(shù)設(shè)定為0.97,表示序列相似度達(dá)到97%即可將其歸屬為同一個(gè)OTU。再挑選代表序列,與數(shù)據(jù)庫比對(duì)后,用RDP分類器將相似度為97%的序列歸到同一種屬。通過對(duì)代表序列做比對(duì),建系統(tǒng)發(fā)育樹,綜合信息生成BIOM格式的table;最后進(jìn)行alpha, beta等一系列后期的分析。Chao1、PD_Whole_tree、Shannon、Observed_speices等指數(shù)用來評(píng)估樣品的α-多樣性�；赑CoA,分析β-多樣性,即不同個(gè)體之間的生態(tài)距離。應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間的比較符合正態(tài)分布的采用兩獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的采取非參數(shù)檢驗(yàn)K組比較,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二章2013年05月,在廣州市某區(qū)衛(wèi)生部門及當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)性病艾滋病防治科的協(xié)調(diào)和配合下,招募了提供商業(yè)性服務(wù)女性性工作者進(jìn)入隊(duì)列。邀請(qǐng)了性病艾滋病防治科的部分工作人員參加了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查取樣工作,他們主要負(fù)責(zé)前期宣傳和研究對(duì)象招募等工作；本實(shí)驗(yàn)室部分人員主要負(fù)責(zé)進(jìn)行問卷訪談、標(biāo)本采集和運(yùn)輸以及數(shù)據(jù)錄入等工作。在研究開始之前對(duì)所有的現(xiàn)場(chǎng)工作人員都進(jìn)行了保密原則、項(xiàng)目特定實(shí)施程序以及接受關(guān)于人類研究對(duì)象保護(hù)知情同意過程的培訓(xùn)。樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物質(zhì)控測(cè)序、PCR產(chǎn)物測(cè)序和數(shù)據(jù)處理與“第一章”相同。我們采用BIPES分析流程分析女性性工作者陰道菌群特征,比較健康體檢中心進(jìn)行體檢的一般女生(Physical Examination Women,PEW)和提供商業(yè)性性服務(wù)的女性性工作者(Commercial Sex Worker,CSW)兩組人群陰道菌群的α、β多樣性和使用LEfSe尋找兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的taxao第三章招募了14位未婚、自述健康的育齡期廣州某高校女大學(xué)生加入月經(jīng)周期陰道菌群變化的縱向研究。研究對(duì)象在2014年03月10至2014年05月03期間個(gè)人進(jìn)行樣品收集。研究對(duì)象每隔兩天使用一次性棉簽拭子在陰道下1/3處輕輕旋轉(zhuǎn)至少十次,然后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱保存,在所有樣品收集完成后轉(zhuǎn)移至南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取。使用細(xì)菌16S通用引物,PCR擴(kuò)增陰道拭子樣品的16S rRNA V4保守區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行PE100-bp測(cè)序后,得到高通量下機(jī)原始?jí)A基序列,采用QIIME分析流程分析隨著月經(jīng)周期陰道菌群是否保持穩(wěn)定。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組計(jì)量資料的比較應(yīng)用One-Way ANOVA, P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：第一章第一、隊(duì)列入組99個(gè)研究對(duì)象,我們總共獲得了1,450,624條高質(zhì)量16S rRNA基因序列,平均每個(gè)樣品14,652條序列。將測(cè)序深度標(biāo)化到2485條,所有的樣品納入后續(xù)分析。第二、廣州地區(qū)女性陰道菌群主要分為五類,其分別以1. L. iners為主要優(yōu)勢(shì)菌；2. L. crispatus為主要優(yōu)勢(shì)菌；3. L. gasseri為主要優(yōu)勢(shì)菌；4. L. crispatus與L. iners同為優(yōu)勢(shì)菌；5.Atopobium, Sneathia, Prevotella和Gardnerella等厭氧菌的一種或兩種為主要優(yōu)勢(shì)菌。第三、陰道pH4.5時(shí),陰道內(nèi)菌群α多樣性升高,微生物種類較多,Prevotella、Sneathia、Anaerococcu、Burkholderia、Bacteroidi、Allisonella、 Dialister和Megasphaera較pH≤4.5有顯著性差異；pH≤4.5的陰道菌群中Lactobacillus,Alliosonella有顯著性差異。第二章第一、隊(duì)列共入組71個(gè)研究對(duì)象,得到共計(jì)1,177,008條高質(zhì)量16S rRNA基因V46序列,平均每個(gè)樣品16,577條序列。將測(cè)序深度標(biāo)化到1212條,所有的樣品納入后續(xù)分析。第二、在屬水平,女性性工作者陰道菌群乳酸桿菌屬只占44.2%,而Garderella、Prevotella和Sneathia則分別占到了約20%、10%和9%。第三、性工作者的陰道菌群主要聚類為1. L. iners為主要優(yōu)勢(shì)菌；2.L.crispatus為主要優(yōu)勢(shì)菌；3.Gardnerella為主要優(yōu)勢(shì)菌；4.Atopobium, Sneathia和Prevotella等厭氧菌的一種或兩種為主要優(yōu)勢(shì)菌。其中以L.iners為優(yōu)勢(shì)菌群的樣品占總樣品數(shù)約42.3%,以L. crispatus為優(yōu)勢(shì)菌群的僅占2.8%。第四、在屬水平上,PEW組中主要富集為Lactobacillus, Burkholderia,在CSW組中主要富集Prevotella、Sneathia、Gardnerella和Escherichia/Shigella等菌屬。第五、不同場(chǎng)所性工作者菌群組成有差異,兩組陰道菌群的總體結(jié)構(gòu)在abund_jaccard和unweighted_unifrac距離的聚類結(jié)果可顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。第六、PEW組和CSW組菌群構(gòu)成有差異,兩組陰道菌群的總體結(jié)構(gòu)在binary_Jaccard和unweighted_unifrac距離的聚類結(jié)果可顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。第三章第一、隊(duì)列最終入組11個(gè)研究對(duì)象,總共收集了202個(gè)樣品,我們獲得共計(jì)3,998,093條高質(zhì)量16SrRNA基因V4序列,序列數(shù)最低為2566條,最高為70,110條,將測(cè)序深度標(biāo)化到1283條,所有的樣品納入后續(xù)分析。平均每個(gè)樣品19,792條序列。第二、陰道菌群隨月經(jīng)周期的變化出現(xiàn)波動(dòng),在月經(jīng)期陰道菌群波動(dòng)最為明顯,優(yōu)勢(shì)菌群在月經(jīng)周期中呈現(xiàn)相互交替或保持絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的變化模式。第三、陰道菌群波動(dòng)的大小因人而異,有些女性陰道菌群隨著月經(jīng)周期發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,而有些女性陰道菌群卻非常穩(wěn)定。第四、陰道菌群受環(huán)境個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣影響顯著,出現(xiàn)按照宿舍居住分簇現(xiàn)象。第五、陰道菌群多數(shù)以乳酸桿菌占優(yōu)勢(shì)地位,而其他則由一個(gè)多樣的厭氧微生物群落組成。研究結(jié)論：一、廣州地區(qū)女性陰道菌群主要分為五類,其分別以1. L. iners為主要優(yōu)勢(shì)菌；2. L. crispatus為主要優(yōu)勢(shì)菌；3. L. gasseri為主要優(yōu)勢(shì)菌；4. L. crispatus與L. iners同為優(yōu)勢(shì)菌；5.Atopobium, Sneathia,Prevotella和Gardnerella等厭氧菌的一種或兩種為主要優(yōu)勢(shì)菌。二、pH≤4.5的陰道菌群中多以Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌,陰道pH4.5時(shí)則嚴(yán)格厭氧性細(xì)菌比例較高。三、陰道菌群受行為習(xí)慣和生活方式影響較大,一般人群和性工作者、不同服務(wù)場(chǎng)所性工作者的陰道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。四、陰道菌群隨月經(jīng)周期的變化出現(xiàn)波動(dòng),波動(dòng)的大小因人而異,在月經(jīng)期陰道菌群波動(dòng)最為明顯,優(yōu)勢(shì)菌群在月經(jīng)周期中呈現(xiàn)相互交替或保持絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的變化模式。
【關(guān)鍵詞】：陰道菌群 細(xì)菌16S rRNA 性工作者 月經(jīng)周期
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.19;R711
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-28
• 第一章 廣州地區(qū)一般女性人群陰道菌群的多樣性28-50
• 1.1 材料和方法28-36
• 1.2 結(jié)果36-45
• 1.3 討論45-49
• 1.4 結(jié)論49-50
• 第二章 廣州地區(qū)女性性工作者陰道菌群多樣性及與一般女性陰道菌群多樣性比較50-71
• 2.1 材料和方法50-52
• 2.2 結(jié)果52-66
• 2.3 討論66-69
• 2.4 結(jié)論69-71
• 第三章 連續(xù)月經(jīng)周期陰道菌群變化71-86
• 3.1 材料和方法71-76
• 3.2 結(jié)果76-81
• 3.3 討論81-85
• 3.4 結(jié)論85-86
• 總結(jié)86-87
• 參考文獻(xiàn)87-96
• 成果96-97
• 附錄97-101
• 致謝101-103

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：431703