本文關(guān)鍵詞：陰道假絲酵母菌病及復(fù)發(fā)性陰道假絲酵母菌病患者陰道菌群結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一種常見(jiàn)外陰陰道炎癥。VVC大約占有癥狀感染者的17%-39%,約占微生物所致陰道炎的25%-30%；其中5%-8%的VVC患者發(fā)展為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC),即一年內(nèi)VVC發(fā)作4次或以上。外陰陰道假絲酵母菌病的致病菌以白假絲酵母菌(Candida albicans,C.albicans)為主,約占60%,其他非白色假絲酵母菌也占相當(dāng)比例。假絲酵母菌寄居于陰道粘膜,它與乳酸桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌等定植菌構(gòu)成陰道正常菌群,菌群之間存在共生及拮抗的關(guān)系,共同形成一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡。細(xì)菌叢能抵抗假絲酵母菌的生長(zhǎng),陰道粘膜預(yù)防真菌侵入,陰道內(nèi)寄生的厭氧菌和乳酸菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞有保護(hù)作用。正常情況下,定植的假絲酵母菌不會(huì)引起任何不適,但當(dāng)女性生殖道內(nèi)的微生態(tài)菌群受到環(huán)境變化、藥物刺激、宿主的激素水平和免疫狀態(tài)低下等因素的影響,平衡狀態(tài)被打破,優(yōu)勢(shì)繁殖的假絲酵母菌引起假絲酵母菌性陰道病。陰道內(nèi)的微生態(tài)平衡狀態(tài)改變,是VVC發(fā)生的重要原因之一。而假絲酵母菌是一種二態(tài)共棲真菌,容易受外界環(huán)境影響而發(fā)生變異,故陰道真菌菌群具有高度多樣性,其結(jié)構(gòu)的改變與RVVC發(fā)生發(fā)展有相互關(guān)系。早期研究主要集中在假絲酵母菌的菌種培養(yǎng)及藥敏情況,較少分析陰道微生態(tài)菌群的整體構(gòu)成與其在疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的變化情況。因此,了解VVC及RVVC患者的陰道微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化,有利于我們了解生殖道假絲酵母病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療及預(yù)防復(fù)發(fā)。陰道菌群主要為厭氧菌,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分離鑒定的方法難以全面認(rèn)識(shí)多樣性的陰道菌群構(gòu)成。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,非培養(yǎng)依賴(lài)性技術(shù)逐漸成熟,研究者可以利用16S rRNA基因聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增這種陰道微生物的非培養(yǎng)法,通過(guò)Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序、結(jié)合帶標(biāo)簽的基于熒光測(cè)序平臺(tái)的雙末端測(cè)序(Barcoded Paired-End Illumina Sequencing, BIPES),可快速、全面了解陰道微生物群落結(jié)構(gòu)信息。目前已有相關(guān)報(bào)道闡明了健康受試者和假絲酵母菌病患者陰道微生物群落菌群組成及其多樣性變化。然而,對(duì)假絲酵母菌病患者積極治療前后其陰道微生物群落菌群的整體結(jié)構(gòu)、組成及變化,至今仍然沒(méi)有深入的研究。欲從病因上達(dá)到假絲酵母菌病治愈的目的,這仍需通過(guò)全面了解疾病狀態(tài)下女性生殖道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化,對(duì)臨床治療與陰道微生態(tài)變化的相關(guān)性進(jìn)一步深入研究。研究目的1、通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)及BIPES的序列研究方法,了解WC和RVVC患者治療前后陰道微生物菌群的結(jié)構(gòu),分析陰道菌群的多樣性改變,了解治療藥物對(duì)WC和RVVC患者陰道菌群改變的差異,探討菌群的改變與治療效果的相關(guān)性。2、追蹤觀(guān)察VVC和RVVC患者在第二觀(guān)察月經(jīng)周期中(為非發(fā)病周期)與原治療前后相對(duì)應(yīng)月經(jīng)周期日的陰道菌群結(jié)構(gòu)信息,了解月經(jīng)周期、疾病因素與患者陰道菌群的相關(guān)性,探討假絲酵母菌病的發(fā)生、康復(fù)與菌群結(jié)構(gòu)改變的相關(guān)性。方法1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象：實(shí)驗(yàn)一：2013年4月-2013年12月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門(mén)診的患者6例,平均年齡(30.16±6.66)歲�；颊呔炇鹬橥鈺�(shū)。VVC組(3例)納入標(biāo)準(zhǔn)：①癥狀：外陰瘙癢、灼痛,可伴有性交痛、尿痛、陰道分泌物增多等；②體征：外陰潮紅、水腫,可伴抓痕或皸裂,小陰唇內(nèi)側(cè)及陰道粘膜潮紅,附著白色膜狀物；陰道內(nèi)可見(jiàn)白色粘稠呈乳膠或豆渣樣分泌物；③實(shí)驗(yàn)室檢查：濕涂片(以生理鹽水和10%KOH制備)證實(shí)存在假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲；或真菌培養(yǎng)培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長(zhǎng)。RVVC組(3例)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合VVC診斷標(biāo)準(zhǔn),并在一年內(nèi)有癥狀并經(jīng)真菌學(xué)證實(shí)的VVC發(fā)作4次或以上。②實(shí)驗(yàn)室檢查：濕涂片(以生理鹽水和10%KOH制備)證實(shí)存在假絲酵母菌的芽生孢子或假菌絲；或真菌培養(yǎng)培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長(zhǎng)。兩組患者確診后予鹽酸特比萘芬陰道泡騰片治療(陰道內(nèi)用藥,50 mg/d,共7d),治療結(jié)束后,患者均自覺(jué)外陰瘙癢癥狀緩解、白帶減少,實(shí)驗(yàn)室濕涂片檢查真菌陰性。實(shí)驗(yàn)二：實(shí)驗(yàn)一中所選取的6例觀(guān)察對(duì)象,分別納入WCⅡ組、RVVCⅡ組,以非發(fā)病期所在月經(jīng)周期為第二觀(guān)察周期。納入標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)驗(yàn)一。患者均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象月經(jīng)規(guī)則,為非妊娠期、哺乳期；排除全身系統(tǒng)性疾病如：糖尿病、激素治療性疾病(如急慢性腎炎)等；排除其他陰道炎如：滴蟲(chóng)性、細(xì)菌性陰道病等；1個(gè)月內(nèi)無(wú)全身應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑、陰道用藥史,3天內(nèi)無(wú)性生活史及陰道灌洗。2.標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)一研究對(duì)象于發(fā)病期用藥前及用藥第8天取材,而實(shí)驗(yàn)二研究對(duì)象于非發(fā)病期中與藥物治療前后相對(duì)應(yīng)的月經(jīng)周期日取材。用無(wú)菌陰道拭子于陰道穹窿處陰道壁取分泌物。將陰道拭子置于無(wú)菌干燥試管中,用于提取細(xì)菌總DNA。標(biāo)本采集后放于4℃標(biāo)本箱保存送檢。3.細(xì)菌總DNA的提取與檢測(cè) 以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取樣本中總DNA,具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。提取的總DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為570)測(cè)定純度和濃度,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后放置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.16s rRNA V4區(qū)基因片段的擴(kuò)增及Illumina測(cè)序以樣本總DNA為模版,采用引物(上海生工生物工程股份有限公司)514F和805R,擴(kuò)增其中的16s rRNAV4區(qū)基因。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特性,經(jīng)回收純化后,通過(guò)Illumina Hiseq2000平臺(tái)進(jìn)行雙末端100 bp測(cè)序(華大基因,深圳)。5.生物信息學(xué)分析所測(cè)得的序列經(jīng)過(guò)BIPES操作進(jìn)行初步處理,保留有效測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪；反向互補(bǔ)組裝V4序列；使用兩階段聚類(lèi)(Twostage-cluste ring, TSC)進(jìn)行聚類(lèi),提取出每個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomy units, OTU)的代表序列后利用全局比對(duì)序列分類(lèi)(Global alignment -for sequence taxonomy, GAST)進(jìn)行物種的分類(lèi),其中屬于乳酸菌屬的OTU利用Blast進(jìn)一步分到種級(jí)別,基于進(jìn)化關(guān)系分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)距離(Unifrac Distance),采用微生物生態(tài)學(xué)定量研究(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, QIIME)進(jìn)行陰道菌群主成分分析。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用率(%)或構(gòu)成比表示,組間比較采用x2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組內(nèi)或組間比較采用方差分析；P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果實(shí)驗(yàn)一：1.測(cè)序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進(jìn)行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)12個(gè),共獲得928028條序列,平均每個(gè)樣品77340條。2.應(yīng)用全聯(lián)聚類(lèi)(Complete linkage)的方法對(duì)VVC組和RVVC組的陰道菌群進(jìn)行聚類(lèi)分析。VVC組和RVVC組陰道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群多樣性未能以疾病分組顯著區(qū)分,而是以個(gè)體菌群為特征聚類(lèi)。VVC組用藥后菌群較用藥前差異明顯,而RVVC組用藥后菌群與用藥前菌群結(jié)構(gòu)更相似。說(shuō)明菌群以個(gè)體為單位聚類(lèi),用藥前后的樣品菌群相似度大于疾病的影響。3.應(yīng)用歐式距離(Euclidean distance)展示VVC組和RVVC組陰道菌群用藥前后的差異。VVC組用藥后的菌群變化幅度較大,RVVC組用藥后菌群差異較小或不變,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.在屬水平分析VVC組和RVVC組用藥前后菌屬構(gòu)成比的差異。顯示VVC組用藥前雙歧桿菌、惰性乳桿菌、加德納菌比例較高,分別占各自標(biāo)本的80%、55%、45%,用藥后菌群中原優(yōu)勢(shì)菌的比例降低約15%～55%,乳酸菌豐度增加成為優(yōu)勢(shì)菌,個(gè)體治療前后的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而藥物治療后RVVC組菌屬構(gòu)成比基本一致,個(gè)體治療前后的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.以O(shè)TU的個(gè)數(shù)測(cè)定(Observed-species)(a)、趙氏菌種豐富度指數(shù)(Chaol)(b)、譜系多樣性(PD-whole-tree)(c)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)(d)四個(gè)指標(biāo)分析,展示VVC組和RVVC組用藥后陰道菌群的a-多樣性未發(fā)生顯著變化。(p均0.05)。6.通過(guò)LEfSe統(tǒng)計(jì)兩組菌屬差異表明,未發(fā)現(xiàn)VVC組和RVVC兩組用藥前后存在差異性菌屬。實(shí)驗(yàn)二：1.測(cè)序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進(jìn)行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)12個(gè),共獲得929032條序列,平均每個(gè)樣品77420條。2.應(yīng)用全聯(lián)聚類(lèi)(Complete linkage)的方法對(duì)VVCⅡ組和RVVCⅡ組的陰道菌群進(jìn)行聚類(lèi)分析。VVCⅡ組和RVVCⅡ組陰道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群多樣性仍以個(gè)體菌群為特征聚類(lèi),VVCⅡ組菌群存在多樣性變化,RVVCⅡ組菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化。兩組陰道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群的差異不顯著(P=0.465)。3.在屬水平分析VVCⅡ組和RVVCⅡ組菌屬構(gòu)成比的差異。每例患者分別采集了用藥前同期(第一個(gè)圖柱)和用藥后同期(第二個(gè)圖柱)的樣品,分析了VVCⅡ組和RVVCⅡ組在非發(fā)病觀(guān)察期用藥前后同期的陰道菌群菌屬,從屬水平對(duì)兩組菌屬構(gòu)成比差異進(jìn)行分析。VVCⅡ組和RVVCⅡ組個(gè)體用藥前后同期的差異不顯著,說(shuō)明非發(fā)病期VVC患者及RWC患者的優(yōu)勢(shì)菌群相似,陰道內(nèi)微生態(tài)處于相似穩(wěn)定狀態(tài)。4.在屬水平分別分析VVC組和VVC Ⅱ組、RVVC組和RVVCⅡ組菌屬構(gòu)成比的差異。每例患者分別采集了用藥前(第一個(gè)圖柱)、用藥后(第二個(gè)圖柱)、用藥前同期(第三個(gè)圖柱)和用藥后同期(第四個(gè)圖柱)的樣品,分析了VVC組、RWC組患者在發(fā)病期和非發(fā)病期同期的陰道菌群菌屬,分別對(duì)兩組菌屬構(gòu)成比差異進(jìn)行分析。VVC Ⅱ組與VVC組優(yōu)勢(shì)菌群差異存在顯著變化(P=0.012),而RWCⅡ組與RVVC組菌群差異仍較相似(P=0.541)。說(shuō)明假絲酵母菌病的偶然發(fā)生可以干擾陰道菌群的平衡；當(dāng)反復(fù)發(fā)作時(shí),假絲酵母菌病與陰道微生物群落優(yōu)勢(shì)菌之間的相關(guān)性則明顯減弱。結(jié)論1.抗菌藥物殺滅假絲酵母菌屬菌同時(shí),降低了假絲酵母菌對(duì)乳桿菌的拮抗作用,從而調(diào)整了陰道菌群的結(jié)構(gòu),使菌群結(jié)構(gòu)逐漸趨向于正常�？拐婢幬镏委煵⒎谴偈够颊叱霈F(xiàn)新的菌屬,而是調(diào)節(jié)陰道菌群自身內(nèi)部的構(gòu)成,恢復(fù)菌群平衡狀態(tài)達(dá)到治療效果。2.VVC組和RVVC組陰道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群多樣性是以個(gè)體菌群為特征聚類(lèi)。VVC組對(duì)藥物治療較敏感,而對(duì)RVVC患者的治療并未引起陰道微生態(tài)的明顯變化。兩組非發(fā)病期患者的陰道微生物優(yōu)勢(shì)菌群與發(fā)病期比較,VVC組有顯著差異,而RVVC組無(wú)明顯差異,說(shuō)明假絲酵母菌病的偶然發(fā)生可以干擾陰道菌群的平衡；當(dāng)反復(fù)發(fā)作時(shí),假絲酵母菌病與陰道微生物群落優(yōu)勢(shì)菌之間的相關(guān)性則明顯減弱。
【關(guān)鍵詞】：外陰陰道假絲酵母菌病 菌群結(jié)構(gòu) 16S rRNA
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R711.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 第一章 WC與RWC患者陰道菌群結(jié)構(gòu)的比較24-39
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料24-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 1.4 討論35-38
• 1.5 小結(jié)38-39
• 第二章 WC與RVVC患者非發(fā)病周期中的菌群結(jié)構(gòu)比較39-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料39-42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-51
• 2.4 討論51-55
• 2.5 小結(jié)55-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 綜述62-77
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 附錄77-79
• 攻讀學(xué)位期間成果79-80
• 致謝80-82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郭莉娜;徐英春;謝秀麗;;假絲酵母菌屬耐藥的分子機(jī)制研究新進(jìn)展[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2009年18期

  本文關(guān)鍵詞：陰道假絲酵母菌病及復(fù)發(fā)性陰道假絲酵母菌病患者陰道菌群結(jié)構(gòu)的對(duì)比分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：337908