【摘要】：目的:雌激素作為一種重要的甾體類激素,廣泛參與機體細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。有研究表明,血液雌激素變化與雌性動物細胞內(nèi)胃饑餓素(GHRL)基因表達呈正相關,說明雌激素可能參與GHRL基因表達的調(diào)控。多囊卵巢綜合征(PCOS)是人類婦科常見病,病癥之一是血液中雄激素水平高,而雌激素水平低。認為PCOS與血液胃饑餓素(GHRL)有關。本研究分為兩部分。第一部分運用Meta統(tǒng)計分析方法,分析人外周血胃饑餓素水平與PCOS關系研究。第二部分研究以綿羊輸卵管上皮細胞為材料,研究雌激素調(diào)控輸卵管上皮胃饑餓素基因表達信號通路,為研究雌激素、胃饑餓素、多囊卵巢綜合征關系奠定基礎。本文首先檢索PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫2015年2月之前的相關文獻,搜索關鍵詞為Ghrelin(GHRL)和PCOS,按照Meta分析方法要求進行搜索,共獲得符合條件的20篇研究文獻。采用Meta分析法,分析了與這些文獻對應的20項研究內(nèi)容,這些研究涉及894例多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和574例正常女性。分析顯示,PCOS患者的血液胃饑餓素(GHRL)水平顯著低于正常女性對照組,標準差(SMD)為-0.71(95%CI:-1.20,-0.23)。其次,通過分子生物學及細胞生物學手段,研究雌激素誘導綿羊輸卵管上皮細胞GHRL表達過程中的GPER/MAPK/ERK1/2信號通路。具體如下:建立綿羊輸卵管上皮細胞培養(yǎng)體系。采用胰酶消化法獲得綿羊輸卵管上皮細胞,進行原代培養(yǎng),通過改善細胞培養(yǎng)環(huán)境增加綿羊輸卵管上皮細胞的純度。通過形態(tài)學、免疫熒光及western blot方法鑒定培養(yǎng)的細胞為上皮細胞。同時,分別在基因水平和蛋白水平檢測綿羊輸卵管上皮細胞中GPER、ERα、ERβ的表達情況。免疫熒光和Western blot檢測傳代細胞上皮標志CK18和E-cadherin,確定所培養(yǎng)的細胞為上皮細胞。免疫組化結(jié)果顯示綿羊輸卵管組織中GPER為細胞膜及細胞質(zhì)著色,ERα及ERβ分布于綿羊輸卵管上皮細胞的細胞核,且ERβ呈弱表達。用傳代綿羊輸卵管上皮細胞作為實驗材料,分別在基因水平和蛋白水平觀察GHRL在綿羊輸卵管上皮細胞中的表達情況。結(jié)果表明綿羊輸卵管上皮細胞中有GHRL基因表達,免疫組化結(jié)果顯示GHRL蛋白主要表達在黏膜層的上皮細胞內(nèi)。分別用不同濃度的GPER受體激動劑G-1和雌激素處理細胞,并在不同時間點收樣,用實時熒光定量PCR檢測GHRL基因的表達水平,結(jié)果顯示G-1和E_2均能顯著上調(diào)GHRL的表達水平,1×10~(-8)mol/L E_2誘導組和1×10~(-7)mol/L G-1誘導組GHRL相對表達量達到最高。最佳誘導劑量的E_2和G-1分別處理細胞6h和3h后,GHRL相對表達量達到最高。為了驗證E_2和G-1與輸卵管上皮細胞增殖的調(diào)控關系,分別使用E_2和G-1處理細胞后,分別檢測輸卵管上皮細胞增殖相關基因PCNA mRNA表達量變化。結(jié)果表明,最適劑量的E_2和G-1處理細胞后PCNA表達水平隨時間增加而升高,呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。取同批次綿羊輸卵管上皮細胞,使用最佳濃度17-β雌二醇處理細胞,然后利用western blot方法在不同時間點檢測MAPK/ERK通路中蛋白組分表達量的變化。結(jié)果顯示,其磷酸化水平p-ERK蛋白表達量從5 min開始逐漸升高,持續(xù)升高至30 min時,達到峰值。取同批次綿羊輸卵管上皮細胞,分別加入最適劑量E_2和GPER激動劑G-1,在30 min時提取細胞總蛋白,檢測MAPK/ERK通路中蛋白組分表達量的變化。結(jié)果顯示,G-1處理組和E_2處理組ERK總蛋白表達量無明顯變化,G-1處理組和E_2處理組磷酸化水平p-ERK蛋白表達量均升高,且明顯高于對照組。免疫組化結(jié)果顯示,綿羊輸卵管黏膜層上皮細胞和固有層細胞均有ERK1/2蛋白表達,主要著色蛋白位于胞質(zhì),少數(shù)胞核也有陽性表達。分別加入GPER的激動劑G-1、GPER激動劑G-1+MAPK/ERK抑制劑U0126(30μM)及E_2+MAPK/ERK抑制劑U0126(30μM)處理細胞6h后,提取細胞總RNA,利用RT-qPCR方法檢測各組GHRL基因表達量的變化情況。結(jié)果顯示,E_2處理組與G-1處理組均顯示出明顯的促進GHRL表達的效應(P0.01),G-1的促進表達能力高于E_2(P0.05)。17-β雌二醇和G-1的促進表達效應均能夠被U0126阻斷(P0.05)。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R711.75
【圖文】：

圖 1 GHRL 發(fā)現(xiàn)過程[5]Fig 1. The GHRL discovery processGHRL 基因及蛋白乳動物中，GHRL是一種促進食欲，并協(xié)調(diào)能量和生殖活動平衡的胃腸布在胃組織中。具有活性的GHRL要經(jīng)歷從GHRL基因到GHRL蛋白的修飾和進化過程。 GHRL 基因結(jié)構及多態(tài)性的 GHRL 基因位于染色體 3p25-26，包括 4 個內(nèi)含子和 5 個外顯子，in 基因也由 5 個外顯子組成[6,7]。雞的 GHRL 基因 DNA 序列全長 27064 個內(nèi)含子連接 5 個外顯子組成。人的 GHRL 第一個外顯子不編碼蛋白顯子只有 20bp，編碼非翻譯區(qū)的一部分。HRL 核心啟動子長約 200bp，上游具有一個長約 5000bp 的調(diào)控序列 基因表達。

圖 2 人和鼠的 GHRL 結(jié)構[5]Fig. 2 The GHRL structure of human and mouse化 GHRL 的過程中，根據(jù)第三位絲氨酸是否酰辛�；� GHRL（C8:0）、脫�；� GHRL（C10:1）。這些 GHRL 由 27 或 28 個氨基酸組氨基酸組成的 GHRL 多羧基端（COOH-）的。GHRL 主要有兩種分子存在形式，即第 3辛�；�，N 端辛�；瘜ι锘钚跃哂兄爻讨�，先產(chǎn)生由 117 個氨基酸組成的前體，然的活性 GHRL。GHRL 前體 N 端的前 23 個氨 24-51（24-50）位的 28（或 27）個氨基酸為端 P-R，即脯氨酸-精氨酸結(jié)構為其識別部位化的 GHRL 一般不具備生物活性[5]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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相關博士學位論文 前2條

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本文編號：2740770