發(fā)布時間：2020-06-08 06:27

【摘要】：卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是常見的婦科惡性腫瘤之一,盡管其發(fā)病率在婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中居第三位,但其死亡率卻高居首位。因卵巢癌的發(fā)病機制復雜,至今仍缺乏有效的診斷分子標記物及治療靶點。因此,尋找針對卵巢癌的獨特分子標志物仍是卵巢癌基礎研究的一項重大課題,一旦有所突破,將能夠有效提高患者生存率,為卵巢癌患者帶來希望。人滋養(yǎng)層細胞表面抗原-2(TROP2)是一種在多種腫瘤中表達的跨膜糖蛋白,由TACSTD2基因編碼,能通過傳遞細胞內的鈣信號、調控ERK/MAPK的信號通路,來參與細胞周期相關蛋白的激活,從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡等惡性生物學行為。TROP2被首次發(fā)現(xiàn)于胎盤的滋養(yǎng)細胞,它在具有干細胞性質的細胞中表達。研究表明TROP2在子宮內膜樣腺癌、宮頸癌、乳腺癌、喉癌和結直腸癌等組織中都有過度表達,該蛋白過表達與多種惡性腫瘤患者的生存率降低以及腫瘤侵襲性和轉移性增加有關,且TROP2在轉移組織中的過度表達使其成為治療晚期惡性腫瘤極具吸引力和潛在的治療靶點。漿液性卵巢癌(Serous ovarian carcinoma,SOC)是卵巢癌中最常見的組織學類型。本研究我們檢測出TROP2蛋白在SOC組織中的高表達,評價其與臨床病理特征和預后之間的關系,并觀察到用siRNA對卵巢癌細胞進行干擾后TROP2的表達明顯下調。我們的結果表明TROP2蛋白過表達與SOC侵襲性進展和不良預后密切相關,是評價SOC不良預后的獨立因素,能促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和轉移。TROP2是一個SOC潛在的預后標志物和靶向治療的新靶點。第一部分TROP2在漿液性卵巢癌中的表達及與Ki-67的相關性研究目的:檢測并分析TROP2在卵巢病變組織及正常卵巢、輸卵管傘組織中的表達,探討TROP2的表達在SOC細胞增殖中的作用及與SOC患者臨床病理特征的相關性。方法:采用免疫組織化學方法檢測126例SOC患者,36例交界性卵巢腫瘤,26例卵巢漿液性囊腺瘤、20例正常卵巢和20例正常輸卵管傘石蠟包埋組織標本中TROP2及Ki-67蛋白的表達;比較不同臨床病理特征的TROP2表達水平,并分析TROP2和Ki-67表達的相關性。結果:1.TROP2蛋白的表達情況卵巢低級別漿液性腺癌(LGSOC)實驗組,采用正常卵巢組織作為正常對照組,正常卵巢組織中TROP2蛋白表達陰性12例(60%),弱陽性7例(35%),中度陽性1例(5%),無強陽性表達。而LGSOC組織中TROP2蛋白陰性6例(10%),弱陽性13例(21.7%),中度陽性20例(5%),強陽性21例(35%),TROP2蛋白表達較正常卵巢、卵巢漿液性囊腺瘤及卵巢交界性腫瘤組織明顯增高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。卵巢高級別漿液性腺癌(HGSOC)實驗組,采用正常輸卵管傘組織作為正常對照組,正常輸卵管傘組織中TROP2蛋白表達陰性10例(50%),呈弱陽性表達8例(40%),中等陽性2例(10%),無強陽性表達。HGSOC組織中TROP2蛋白表達陰性8例(12.1%),弱陽性16例(24.2%),中等陽性22例(33.3%),強陽性表達20例(30.3%),TROP2蛋白表達較對照組正常輸卵管傘組織明顯增高(P0.05)。2.TROP2蛋白表達與SOC的FIGO臨床分期、腫瘤病理分級、術前血清CA125水平、腹水和淋巴結轉移關系密切(P0.05),而其表達與卵巢癌患者年齡及鉑耐藥無相關性(均為P0.05)。3.Ki-67在卵巢低級別及高級別漿液性腺癌中的表達明顯高于對照組及良性病變組織(P0.05)。Spearman等級相關分析顯示,TROP2和Ki-67在SOC組織中的表達具有相關性(P0.05)。結論:1.TROP2在SOC組織中表達升高,與SOC的不良臨床病理特征密切相關,說明TROP2參與SOC的發(fā)生發(fā)展過程。2.TROP2與Ki-67蛋白表達呈正相關,提示TROP2可能參與SOC細胞的增殖及侵襲過程。第二部分126例漿液性卵巢癌患者的臨床資料統(tǒng)計及生存分析目的:進一步探究此項研究第一部分中影響SOC患者預后的相關因素。分析TROP2的表達、FIGO臨床分期、腫瘤病理分級、術前血清CA125水平、腹水、淋巴結轉移及年齡等不同因素對SOC患者生存時間的影響。方法:采集入組與第一部分中的SOC癌相同的患者病例,共計126例SOC患者。患者在山東大學附屬齊魯醫(yī)院行手術且及時完成治療,并保存了完整的病例記錄和隨訪資料,術后隨訪時間60個月,隨訪信息包括總生存時間(OS)和無進展生存時間(PFS)。采用Kaplan-Meier法進行生存時間的比較,并繪制生存曲線;采用單因素、多因素Cox比例風險回歸分析,篩選影響預后的主要因素。結果:1.單因素分析顯示:TROP2蛋白過表達與無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)有相關性(均為P0.05)。在FIGO臨床分期、腫瘤病理分級、術前血清CA125水平、腹水和淋巴結轉移方面,患者中位生存期具有統(tǒng)計學差異(P0.05),而年齡50歲和≥50歲兩組患者中位生存期無統(tǒng)計學差異。2.多因素COX回歸模型分析結果顯示:TROP2的表達、FIGO臨床分期、術前血清CA125水平、腹水和淋巴結轉移情況是影響SOC患者五年生存率的獨立因素。結論:1.TROP2的過表達導致SOC患者的不良預后,是評價SOC預后的獨立因素。2.FIGO臨床分期、術前血清CA125水平、腹水和淋巴結轉移也是影響卵巢癌預后的危險因素。第三部分TROP2的表達對卵巢癌生物學行為的影響目的:觀察TROP2表達水平的變化對卵巢癌細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力等生物學行為的影響,探索TROP2在卵巢癌腫瘤的形成發(fā)展中的作用及可能的機制。方法:我們合成了兩個獨立的siRNA序列siRNA-550和siRNA-1100序列來轉染卵巢癌細胞,干擾沉默TROP2的內源性表達。用Western Blot檢測轉染后TROP2蛋白的表達量;用CCK-8法測定TROP2表達水平的改變對卵巢癌細胞增殖能力的影響;分別用劃痕實驗和侵襲實驗來測定細胞的遷移和侵襲能力;使用Western Blot法測定凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達。結果:1.免疫熒光染色分析顯示:在A2780、HO8910和SK-OV-3細胞表面均有一層紅色熒光染色。Western Blot檢測結果表明TROP2蛋白在3種細胞中均有表達,其中A2780細胞系中TROP2的表達比其它兩個細胞系更高。2.用轉染序列siRNA-550和siRNA-1100對A2780進行干擾后,TROP2蛋白表達明顯降低。3.用CCK-8法研究發(fā)現(xiàn):TROP2基因沉默的A2780細胞增殖能力顯著降低(P0.05)。4.通過細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn):TROP2基因沉默后的卵巢癌細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)量明顯降低(P0.05),說明細胞侵襲能力降低。5.細胞劃痕試驗顯示在進行細胞劃痕24和48小時后,TROP2基因沉默后的卵巢癌細胞具有顯著較慢的劃痕愈合速度(P0.05),說明細胞遷移能力顯著下降。6.Western Blot法測定凋亡相關蛋白顯示:TROP2基因沉默后的卵巢癌細胞Bcl-2蛋白的表達顯著下降,而Bax蛋白表達顯著增強。結論:通過沉默卵巢癌A 2780細胞的TROP2基因,發(fā)現(xiàn)TROP2基因參與卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移。TROP2基因通過破壞Bax/Bcl-2家族蛋白之間的平衡調節(jié)來誘導細胞凋亡。
【圖文】：

邐６０逡逑Ｏｖｅｒａｌｌ邋Ｓｕｒｖｉｖａｌ（ｍｏｎｔｈｓ）逡逑圖２－２不同ＦＩＧＯ分期的ＳＯＣ患者Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線圖逡逑對４８例“Ｉ期＋ｎ期”、７８例“ｍ期＋ＩＶ期”的ＳＯＣ患者生存分析。Ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ，逡逑總生存期；尸＜０．００１；風險比率ＨＲ＝５．１１９；置信區(qū)間９５％邋Ｃｌ：邋２．５９６？１０．０９５。逡逑４６逡逑

（Ａ）邐（Ｂ）逡逑圖２－１與ＴＲＯＰ２表達相關的漿液性卵巢癌患者Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。逡逑Ａ：總體生存期（ＯＳ），尸＝０．０１７。Ｂ：無進展生存率（ＰＦＳ），尸＜０．００１�？傮w逡逑風險比率ＨＲ＝１．９１６；置信區(qū)間９５％ＣＩ：邋１．１０８？３．３１２。逡逑１０－邐邐ｐ邋，邐／＞＜000！邐ＦＩＧＯ．Ｕｇｅ：逡逑個邐＂ｔ＂１邋ｌ－Ｄ－？ｎ？ｏｎ＾逡逑Ｌ．邐？—ｊ邐—ｆ—邋ｌｌ－ＩＶ邋ｒｍａｍｌ逡逑０８－邐＼邐＾￣Ｉ——ｈ逡逑0邋０６－邐？邋ｔ邋，逡逑！邋＇＇＇逡逑１逡逑ｏ逡逑０邋２－逡逑ｏｏ－逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐１０邐２０邐３０邐？０邐５０邐６０逡逑Ｏｖｅｒａｌｌ邋Ｓｕｒｖｉｖａｌ（ｍｏｎｔｈｓ）逡逑圖２－２不同ＦＩＧＯ分期的ＳＯＣ患者Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線圖逡逑對４８例“Ｉ期＋ｎ期”、７８例“ｍ期＋ＩＶ期”的ＳＯＣ患者生存分析。Ｏｖｅｒａｌｌ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ，逡逑總生存期；尸＜０．００１；風險比率ＨＲ＝５．１１９；置信區(qū)間９５％邋Ｃｌ：邋２．５９６？１０．０９５。逡逑４６逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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本文編號：2702680