【摘要】：目的研究并闡明妊娠期鎘暴露對F1代大鼠成年后卵巢顆粒細胞生長和激素合成功能的影響及其DNA甲基化模式改變,為進一步闡明鎘致卵巢細顆粒細胞胞損傷及其表遺傳機制提供科學依據(jù)。方法SPF級成年SD大鼠,合籠受孕后,于妊娠第1-20天分別暴露于0、0.5、2.0、8mg/kg CdCl2,灌胃染毒,每天一次。F1代雌鼠于出生后第56天時,取卵巢顆粒細胞穩(wěn)定培養(yǎng)24h貼壁后收集細胞(10×10~6個/ml)及上清液備用。第一部分妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細胞凋亡的影響(1)觀察顆粒細胞亞顯微結構(透射電子顯微鏡);(2)檢測卵巢顆粒細胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染);(3)檢測卵巢顆粒細胞Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Caspase3、及Caspase8基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表達(Western-blot法)。第二部分妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細胞激素合成的影響(1)檢測顆粒細胞上清液孕酮、雌二醇水平(ELISA法);(2)檢測顆粒細胞StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1及Cyp19 a1基因mRNA(RT-PCR法)和蛋白表達(Western-blot法)第三部分F1代大鼠成年后顆粒細胞全基因組DNA啟動子區(qū)甲基化研究(1)檢測卵巢顆粒細胞(n=3)全基因組DNA甲基化啟動子區(qū)差異基因表達譜(免疫共沉淀法);(2)差異甲基化基因GO分析;(3)差異甲基化基因KEGG信號通路分析。第四部分:根據(jù)芯片檢測結果及生物信息學分析提示驗證Eif2s1、Atf4啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)(1)啟動子在線分析軟件Methl Primer Express及SignalMap確定Eif2s1、Atf4基因啟動子區(qū)差異峰落在CpG島;(2)驗證Eif2s1、Atf4基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)(BSP法);(3)測定Eif2s1、Atf基因的mRNA表達水平(RT-PCR)。結果第一部分:妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細胞凋亡的影響(1)與對照組相比,各染鎘組出現(xiàn)的凋亡細胞及凋亡小體數(shù)量增加,顆粒細胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核、染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度損傷。(2)與對照組比,各染鎘組凋亡率均升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(3)與對照組相比,各染鎘組Bcl-2、Bcl-xl及Bcl-2/Bax mRNA和蛋白表達均出現(xiàn)不同程度的下調(diào),Caspase3基因mRNA差異無統(tǒng)計學意義,蛋白表達出現(xiàn)不同程度上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),各染鎘組Bax、Caspases8基因mRNA及蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義。第二部分:妊娠期鎘暴露致F1代大鼠成年后顆粒細胞激素合成的影響(1)與對照組相比,各染鎘組顆粒細胞上清孕酮水平顯著性下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而雌二醇水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)各染鎘組StAR、Cyp11a1基因mRNA及蛋白表達均顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),Cyp17a1、Cyp19a1基因mRNA及蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),SF-1基因mRNA表達出現(xiàn)不同程度改變,但蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。第三部分F1代大鼠成年后顆粒細胞全基因組DNA啟動子區(qū)甲基化研究(1)與對照組相比,8.0mg/kg組基因組DNA發(fā)生低甲基化基因的數(shù)量高于發(fā)生高甲基化的基因數(shù),且主要發(fā)生在高密度啟動子和中密度啟動子區(qū)。(2)GO分析提示妊娠鎘暴露對F1代大鼠成年后卵巢顆粒細胞相應的生物學過程、分子功能及細胞組分產(chǎn)生影響。(3)差異性甲基化Pathway分析提示,與對照組相比,鎘暴露對F1代大鼠顆粒細胞48條通路產(chǎn)生影響,其中凋亡通路中Eif2s1、Atf4等14個基因啟動子區(qū)發(fā)生了高甲基化,Bcl-xl基因啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化,未見Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)生改變;激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化,未見StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1、Cyp19a1基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生改變。第四部分根據(jù)芯片檢測結果及生物信息學分析等結果提示驗證Eif2s1、Atf4啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)(1)Eif2s1、Atf4基因啟動子特定區(qū)域出現(xiàn)高甲基化峰,此峰落在相應基因CpG島。(2)與對照組相比,各染鎘組Eif2s1、Atf4基因mRNA表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)與對照組相比,8.0mg/kg組Eif2s1基因啟動子區(qū)平均甲基化率增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),Atf4基因啟動子區(qū)平均甲基化率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論根據(jù)以上結果,可得出如下結論1.妊娠期鎘暴露可致F1代大鼠成年后卵巢顆粒細胞生長和功能產(chǎn)生影響。2.妊娠期鎘暴會改變F1代大鼠成年后顆粒細胞全基因組DNA甲基化狀態(tài),引起凋亡及激素合成相關基因甲基化模式發(fā)生改變。3.本實驗條件下Eif2s1--Atf4通路被抑制,DNA甲基化可能參與其抑制Eif2s1基因mRNA表達的調(diào)控,但可能未參與其抑制Atf4基因mRNA表達的調(diào)控。
【圖文】：

結果第一部分 妊娠期鎘暴露致 F1 代卵巢顆粒細胞凋亡的影響1 透射電子顯微鏡觀察 F1 代大鼠卵巢顆粒細胞亞顯微結構使用透射電鏡對不同劑量體外鎘暴露后大鼠卵巢顆粒細胞的亞顯微結構進行觀察，結果顯示：如圖 1.1 A 所示，對照組大鼠卵巢顆粒細胞膜完整，細胞核核膜清楚，核染色質(zhì)分布均勻，，未見異染色質(zhì)，線粒體豐富，其結構及線粒體清楚完整；如圖 1.1B 所示，可見兩個凋亡小體，凋亡小體，凋亡小體內(nèi)線粒體脹，嵴稀疏；如圖 1.1C 所示，細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮，細胞核邊集，染色固縮；如圖 1.1D 所示，細胞體積變小，核分裂，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，亡小體。A B

2 妊娠期鎘暴露致 F1代大鼠成年后顆粒細胞激素合成的影響Annexin V-FITC/PI 雙染法對各組 F1代大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況進行檢測。如圖1.2 A 所示，0、0.5、2.0和8.0 mg/ kg 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率分別為11.35%，19.28%，22.41%，19.65%；如圖1.2 B 和表1.1所示，與對照組比較，0.5、2.0和8.0 mg/ kg 細胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計學意義( P＜0.01)。A0mg/kg 0.5mg/kg2.0mg/kg 8.0mg/kg
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R715.3

【參考文獻】

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1 賈廣樂;王眾;吳紹強;林祥梅;韓雪清;劉建;梅琳;張e

本文編號：2632768