【摘要】：背景與目的卵巢癌缺乏有效的早期診治方法,患者大多預(yù)后不良,高級(jí)別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer，HGSOC)惡性度較其他腫瘤類型高。盡管近年在HGSOC研究和治療方面取得了顯著進(jìn)展,但HGSOC潛在分子發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。類固醇-5α還原酶3(steroid-5a redutase3,SRD5A3)屬于類固醇-5a還原酶家族中的一員,SRD5A3表達(dá)水平的上調(diào)與人類腫瘤表現(xiàn)惡性生物學(xué)行為之間存在一定的相關(guān)性。然而,SRD5A3在高級(jí)別漿液性卵巢癌中的表達(dá)水平及其發(fā)揮的生物學(xué)作用尚未完全闡明。該實(shí)驗(yàn)探究了SRD5A3在HGSOC組織及細(xì)胞系的表達(dá)與在正常輸卵管傘組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平差異,并分析了 SRD5A3表達(dá)水平與HGSOC患者不良預(yù)后之間的關(guān)系,通過上調(diào)或者下調(diào)SRD5A3表達(dá)研究SRD5A3對HGSOC生物學(xué)行為的影響,探索其作為HGSOC患者預(yù)后標(biāo)志物的潛力,及基因靶向治療靶點(diǎn)的可能性。材料與方法通過實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)及Western印跡(WB)分析SRD5A3在正常對照和癌組織中的表達(dá)。采用免疫組化技術(shù)分析SRD5A3在FT和HGSOC中的蛋白水平差異及SRD5A3表達(dá)水平與HGSOC患者生存期及臨床生化特征之間的相關(guān)性。構(gòu)建SRD5A3過表達(dá)及干擾表達(dá)的質(zhì)粒,利用慢病毒感染技術(shù)建立過表達(dá)及干擾表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞。MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)用于研究SRD5A3對卵巢癌細(xì)胞生長和增殖的影響,Transwell實(shí)驗(yàn)用于研究SRD5A3在卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用。將一定濃度梯度的順鉑和SRD5A3小分子抑制劑應(yīng)用于卵巢癌細(xì)胞,分析SRD5A3與卵巢癌細(xì)胞順鉑化療耐藥的關(guān)系,并通過MTT法檢測順鉑和SRD5A3小分子抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對順鉑治療卵巢癌出現(xiàn)的化療耐藥的影響。研究結(jié)果HGSOC組織中SRD5A3的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于FT組織;在HGSOC患者中SRD5A3高表達(dá)組的存活時(shí)間較SRD5A3低表達(dá)組短,且SRD5A3表達(dá)水平與HGSOC患者鉑類化療耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間具有相關(guān)性。SRD5A3表達(dá)上調(diào)后,卵巢癌細(xì)胞生長速度加快,克隆形成能力增強(qiáng),周期檢測結(jié)果表明過表達(dá)SRD5A3會(huì)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化,下調(diào)SRD5A3表達(dá)會(huì)導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期;RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞周期相關(guān)分子mRNA水平結(jié)果表明,SRD5A3過表達(dá)后,A2780細(xì)胞系C-MYC,CDK2，CCNE1,CDK4，CDK6，CCND1 水平升高,P21,P27水平降低;SRD5A3干擾后結(jié)果相反;利用WB技術(shù)發(fā)現(xiàn)上述分子蛋白水平發(fā)生相應(yīng)改變。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明,SRD5A3表達(dá)上調(diào)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞穿越至Transwell小室下室;干擾SRD5A3后,結(jié)果相反;采用RT-PCR技術(shù)檢測EMT相關(guān)分子及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平,SRD5A3過表達(dá)后上皮性標(biāo)志分子E-cadherin水平降低,而間質(zhì)性分子N-cadherin,vimentin,ZEB1水平升高,SRD5A3干擾后結(jié)果相反;利用Western Blot檢測EMT相關(guān)分子及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白水平,SRD5A3過表達(dá)后上皮性分子E-cadherin表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)分子N-cadherin,vimentin,ZEB1表達(dá)明顯上調(diào),SRD5A3干擾后結(jié)果相反。RT-PCR顯示增加順鉑作用濃度,SRD5A3的mRNA水平增加;Western blot顯示延長順鉑作用時(shí)間,SRD5A3的蛋白水平增加,而且上調(diào)SRD5A3的表達(dá),自噬相關(guān)分子Atg12及LC3 I/II的蛋白水平增加,P62的蛋白水平減少,敲低SRD5A3的表達(dá),結(jié)果相反;藥物MTT實(shí)驗(yàn)顯示增加小分子抑制劑作用濃度和作用時(shí)間,卵巢癌細(xì)胞的生長抑制率增加;耐藥MTT實(shí)驗(yàn)顯示增加順鉑作用濃度,SRD5A3干擾的卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞抑制率較對照對增加;將順鉑與小分子抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于將順鉑或小分子抑制劑單獨(dú)應(yīng)用。SRD5A3過表達(dá)后P13K，p-AKT，p-mTOR的蛋白水平升高,SRD5A3 干擾后P13K，p-AKT,p-mTOR的蛋白水平降低。研究結(jié)論1.SRD5A3在HGSOC中高表達(dá),且其表達(dá)水平與HGSOC患者不良預(yù)后、鉑類化療耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);2.SRD5A3通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞周期來增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的生長和增殖;3.SRD5A3通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)分子的表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT,從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移;4.SRD5A3通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的自噬參與鉑類化療耐藥;5.降低SRD5A3表達(dá)或者使用SRD5A3的小分子抑制劑可以增強(qiáng)順鉑化療的敏感性;6.SRD5A3在卵巢癌中起的生物學(xué)功能伴有P13K/AKT/mTOR通路激活。因此,SRD5A3可能是潛在的HGSOC患者生存預(yù)后的標(biāo)志物和其治療的靶點(diǎn)。
【圖文】：

ＲＮＡ及蛋白質(zhì)，通過ＷＢ實(shí)驗(yàn)分析了邋ＳＲＤ５Ａ３在６例ＦＴ組織和１０例ＨＧＳＯＣ組逡逑織中蛋丨＇１表達(dá)水平，結(jié)果表明ＨＧＳＯＣ組織中ＳＲＤ５Ａ３的蛋白表達(dá)水平顯著高于逡逑ＦＴ組織（Ｐ＜０．０００１圖１Ａ）；隨后我們通過ｑＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)分析了邋１３例ＦＴ組織逡逑和２８例ＨＧＳＯＣ組織中ＳＲＤ５Ａ３的ｍＲＮＡ表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與ＦＴ相比，ＨＧＳＯＣ組逡逑織中ＳＲＤ５Ａ３ｍＲＮＡ表達(dá)水平明顯X椉櫻ǎ校劍埃埃埃矗罰跡保攏晃頤侵譜髁寺殉舶╁義獻(xiàn)櫓酒ǎ裕停粒┎⑼ü桑齲萌舊際醴治雋隋澹櫻遙模擔(dān)粒吃冢矗襖疲宰櫓停保罰崩義希齲牽櫻希米櫓校櫻遙模擔(dān)粒車鞍妝澩鎪劍櫻遙模擔(dān)粒橙舊婪直曜嘉焊菔櫓義锨釁舊咳�，将其分为４级，，阴袆蚺f海胺鄭躚糶勻舊海狽鄭械妊糶藻義先舊海卜鄭墾糶勻舊海撤鄭ㄍ跡保茫桓菅糶韻赴舊婊俜直齲義掀浞治錘齙燃�，０－２�(dān)ハ赴舊海狽鄭玻叮擔(dān)埃ハ赴舊海卜鄭擔(dān)保罰擔(dān)ハ稿義習(xí)舊海撤鄭罰叮保埃埃ハ赴舊海捶鄭喚舊慷繞婪鄭舊婊婪旨撲鬮義獻(xiàn)莧舊婪幀Ｆ婪紙峁允

本文編號(hào)：2610211