【摘要】：研究背景 子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,在女性惡性腫瘤中,發(fā)病率僅次于乳腺癌。子宮頸癌嚴(yán)重威脅著女性的健康。全球范圍內(nèi),每年約有50萬(wàn)新發(fā)病例,約有20多萬(wàn)女性死于子宮頸癌,大約80%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,可能與發(fā)展中國(guó)家子宮頸癌的篩查與治療條件有關(guān)。我國(guó)每年新發(fā)病例約13萬(wàn),且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì)。90%以上人宮頸癌的發(fā)病原因與高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染有關(guān),主要為HPV16、18亞型。隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普遍推廣應(yīng)用,宮頸癌前病變及宮頸癌的早期診斷及治療得到改善,子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已有所下降。但其發(fā)病機(jī)制至今仍并不完全清楚。 近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,已經(jīng)證明由于遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)(epigenetic)的改變使抑癌基因的失活和癌基因的激活在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。表觀遺傳學(xué)定義為未涉及DNA序列的改變,但可通過(guò)細(xì)胞的有絲分裂而遺傳的基因功能的改變。表觀遺傳異常主要包括DNA甲基化異常、組蛋白修飾改變、基因組印記缺失及非編碼RNA異常調(diào)節(jié)等。其中目前研究最多的是DNA的甲基化及組蛋白乙�；Ｔ絹�(lái)越多的證據(jù)表明,抑癌基因啟動(dòng)子的異常甲基化、組蛋白異常修飾異常等表觀遺傳學(xué)的改變與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。丙戊酸鈉(valproic acid, VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物,同時(shí)能夠抑制組蛋白去乙�；�(histone deacetylase, HDAC)的活性,使組蛋白去乙酰化減少,在多種腫瘤中有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和分化的作用。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是維生素A的生物活性代謝產(chǎn)物,與其受體RARβ2(retinoic acid receptor β2,)結(jié)合,具有促進(jìn)上皮細(xì)胞分化成熟的作用,其已作為一種誘導(dǎo)分化劑用于臨床腫瘤治療。研究表明,RARβ2在包括子宮頸癌在內(nèi)的許多腫瘤中表達(dá)減少,其表達(dá)調(diào)控與組蛋白的甲基化及去乙酰化密切相關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),VPA聯(lián)合ATRA可以提高宮頸癌細(xì)胞株組蛋白乙酰化程度,通過(guò)表觀遺傳途徑重啟/上調(diào)RARβ2的表達(dá)。由此,我們推測(cè)ATRA即可通過(guò)與RARβ2結(jié)合,啟動(dòng)上皮細(xì)胞正常分化成熟途徑,上調(diào)E-cadherin及上皮細(xì)胞分化指標(biāo)Filaggrin、 Involucrin和Loricrin的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)分化和抗腫瘤作用。 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(Three-dimensional cell culture,TDCC)是指將細(xì)胞培養(yǎng)于具有三維結(jié)構(gòu)的載體,使細(xì)胞在載體的三維空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng),從而形成細(xì)胞-載體三維復(fù)合物。TDCC既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境,又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì),在對(duì)藥物毒理和藥效的評(píng)估試驗(yàn)中具有重要應(yīng)用。TDCC在體外構(gòu)建與體內(nèi)相近的細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)系統(tǒng),為針對(duì)腫瘤微環(huán)境的藥物設(shè)計(jì)提供了很好的模型。 本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建子宮頸癌細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型,探討VPA聯(lián)合ATRA對(duì)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中子宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及誘導(dǎo)分化作用,從而為尋求新的子宮頸癌治療方法提供參考。 目的 探討VPA聯(lián)合ATRA對(duì)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中子宮頸癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。 方法 HeLa和SiHa細(xì)胞株接種于培養(yǎng)支架,構(gòu)建宮頸癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型；實(shí)驗(yàn)分為三組,實(shí)驗(yàn)組采用VPA (3mmol/L)與ATRA (1μmol/L)聯(lián)合處理,拮抗劑組在VPA和ATRA聯(lián)合作用的同時(shí)加入PI3K抑制劑LY-294002處理,對(duì)照組僅加入等量DMSO;2周后,收獲支架,石蠟包埋、切片,采用免疫熒光檢測(cè)維甲酸受體RARβ2、E-cadherin及上皮細(xì)胞分化指標(biāo)Filaggrin\Involucrin和Loricrin的表達(dá)；利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)RARβ2/p-AKT、E-cadherin/p-AKT與p-Akt/Involucrin表達(dá)的時(shí)空關(guān)系,分析PI3K/Akt通路的調(diào)控作用。 結(jié)果 (1)VPA聯(lián)合ATRA作用于三維培養(yǎng)細(xì)胞模型,腫瘤形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,SiHa與HeLa細(xì)胞復(fù)層數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少；(2)與對(duì)照組比較,VPA聯(lián)合ATRA上調(diào)三維培養(yǎng)模型中HeLa和SiHa細(xì)胞RARβ2及E-cadherin的表達(dá)(p0.01),進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化標(biāo)記Filaggrin、Involucrin和Loricrin的表達(dá)(p0.05)；(3)加入LY-294002后RARβ2和E-cadherin的表達(dá)無(wú)明顯變化,但顯著抑制Akt的磷酸化p0.01),分化指標(biāo)的表達(dá)顯著降低(p0.01)。 結(jié)論 VPA聯(lián)合ATRA可誘導(dǎo)三維培養(yǎng)模型中子宮頸癌細(xì)胞的分化；上調(diào)RARβ2及E-cadherin的表達(dá),通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用是其可能的作用機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃泓,王立峰,田海梅,劉毅,李茉,曲平,王吾茹,張偉;維甲酸受體-β等腫瘤分子標(biāo)志物在食管正常及異常組織中的表達(dá)及意義[J];中華腫瘤雜志;2005年03期

2 曹振平;馮定慶;徐嶸嶸;李彩榮;周穎;凌斌;;丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷機(jī)制研究[J];腫瘤;2010年10期

3 許旭;孫敬巖;顧林;張麗娜;張宇;付麗;;RAR-β2基因在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)腫瘤臨床;2010年02期

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本文編號(hào)：2586308