發(fā)布時(shí)間：2019-01-12 20:45

【摘要】：研究背景 卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer, EOC)的病死率高居?jì)D科惡性腫瘤之首,晚期患者的5年生存率僅約30%。目前,腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的化療,對(duì)約70%的晚期患者初期治療有效,但大部分患者最終會(huì)出現(xiàn)化療耐藥導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。因此,深入認(rèn)識(shí)EOC的進(jìn)展機(jī)制,有效改善EOC的不良預(yù)后是目前臨床亟待解決的難題。 新近的研究發(fā)現(xiàn),EOC化療耐藥與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)降低、細(xì)胞間連接變得疏松、細(xì)胞骨架重塑,轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)細(xì)胞表型過(guò)程。已有的研究證實(shí)EMT在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中具有重要的調(diào)控作用。更重要的是,有研究發(fā)現(xiàn)EOC中存在的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)具有EMT的特征。CSCs學(xué)說(shuō)認(rèn)為：腫瘤是由異質(zhì)性的細(xì)胞群體構(gòu)成；其中存在極少量具有干細(xì)胞性質(zhì)的癌細(xì)胞亞群,是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及耐藥性產(chǎn)生的根源。因此,抑制EMT可能成為有效改善EOC預(yù)后的策略。 微小RNA(microRNA, miRNA, miR)是一類(lèi)非編碼的單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度約18-24個(gè)核苷酸(nucleotide, nt),其通過(guò)與mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)堿基識(shí)別配對(duì),調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)miRNAs在調(diào)控EMT中具有重要作用,亦與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切。Yang,等分析了459例EOC腫瘤組織的mRNA及miRNAs表達(dá)譜特征,證實(shí)間充質(zhì)表型與EOC的不良預(yù)后相關(guān),包括miR-20a、miR-141和miR-506在內(nèi)的8個(gè)關(guān)鍵miRNA,調(diào)控了高達(dá)89%的間充質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)。 miR-200a和miR-141同屬于miR-200家族(miR-200s,包括miR-200a/b/c/和miR-141/429共5個(gè)miRNA)。近年的研究發(fā)現(xiàn)miR-200s在多種腫瘤中具有阻礙EMT進(jìn)程、抑制CSCs自我更新和去分化狀態(tài)、調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡、逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。在EOC中已證實(shí)miR-200s的表達(dá)水平與化療敏感性、無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)以及總生存期(overall survival, OS)呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果說(shuō)明以miR-200s作為EOC潛在的治療策略,具有理論上的可行性和積極的臨床意義。 有研究證實(shí),在EOC細(xì)胞株Hey中,過(guò)表達(dá)miR-200c通過(guò)靶向調(diào)控TUBB3增加了紫杉醇的敏感性。我們前期在卵巢漿液性腺癌細(xì)胞系--OVCAR-3中驗(yàn)證了CD133+細(xì)胞具有CSCs特征；進(jìn)一步用miRNA芯片發(fā)現(xiàn)CD133+與CD133-細(xì)胞間存在miRNAs的差異表達(dá)譜；其中miR-200a在CD133+細(xì)胞中下調(diào)了約2.16倍,利用合成的miR-200a模擬物—miR-200a mimics,在CD133±細(xì)胞中瞬時(shí)上調(diào)miR-200a水平,發(fā)現(xiàn)miR-200a通過(guò)靶向下調(diào)ZEB2抑制了CD133+細(xì)胞的遷移和侵襲能力,初步證實(shí)miR-200a在EOC中具有抑制轉(zhuǎn)移的積極作用。但目前關(guān)于miR-200a對(duì)EOC化療敏感性和CSCs的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。 我們發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,miR-200a mimics的方法僅適用于短期內(nèi)觀察,miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞的影響；并且分選得到的CD133+細(xì)胞所占比例非常低(約0.2-1%)；另外,CD133+細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中逐漸分化為CD133-細(xì)胞的問(wèn)題,都將為我們深入探索miR-200a在EOC中的生物學(xué)功能帶來(lái)一定的局限性。近來(lái),Wang,等用基因芯片鑒定了無(wú)血清培養(yǎng)OVCAR-3所形成的懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞球,具有CSCs的特征,適宜作為研究EOC中CSCs的體外模型。 綜合考慮上述因素,本課題首先利用慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建了穩(wěn)定上調(diào)miR-200a的EOC細(xì)胞模型,在普通貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)條件下,驗(yàn)證了miR-200a對(duì)EOC化療敏感性的影響；進(jìn)一步探索了miR-200a調(diào)控EOC增殖狀態(tài)和CSCs的作用及其機(jī)制,以期為改善EOC的預(yù)后帶來(lái)更新更有力的治療策略。 第一章構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-200a的EOC細(xì)胞模型 目的： 利用慢病毒表達(dá)載體,構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-200a的貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型,為深入探索miR-200a對(duì)EOC的生物學(xué)作用及其機(jī)制提供平臺(tái)。 方法： 1. miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒載體和對(duì)照空載體的鑒定。 miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒載體pLV-miR-200a和對(duì)照空載體pLV-control購(gòu)自深圳市華安平康生物科技有限公司。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、PCR擴(kuò)增、DNA電泳以及DNA測(cè)序,鑒定miR-200a慢病毒表達(dá)載體和對(duì)照空載體。 2. miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照慢病毒的包裝。 慢病毒包裝元件psPAX2和pMD2.G由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供,pLV-miR-200a或pLV-control、psPAX2和pMD2.G共同組成慢病毒包裝系統(tǒng)。用Lipofectamine2000將慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝生產(chǎn)攜帶miR-200a過(guò)表達(dá)的慢病毒和對(duì)照慢病毒。 3. miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照慢病毒感染EOC細(xì)胞。 用攜帶]miR-200a過(guò)表達(dá)的慢病毒和對(duì)照慢病毒,分別感染EOC細(xì)胞株OVCAR-3,在倒置熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因一綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的表達(dá),以監(jiān)測(cè)感染效率,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選GFP+細(xì)胞。 4.驗(yàn)證miR-200a在感染后EOC細(xì)胞中的表達(dá)水平。 提取經(jīng)流氏細(xì)胞儀分選后EOC細(xì)胞的總RNA, qRT-PCR檢測(cè)miR-200a的表達(dá)水平,大量擴(kuò)增并凍存高表達(dá)miR-200a的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 5.建立miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型。 收集過(guò)表達(dá)miR-200a的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,分別用PBS洗滌2次,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基(含EGF20ng/mL、bFGF10ng/mL、0.4%BSA、 insulin5μg/mL、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM/F12),接種于超低吸附培養(yǎng)皿,常規(guī)條件培養(yǎng),間隔72h添加適量腫瘤球培養(yǎng)基,7d后收集球體細(xì)胞,用0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1：1混合液消化球體細(xì)胞,繼續(xù)用上述方法傳代培養(yǎng),得到懸浮生長(zhǎng)的EOC細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)懸浮生長(zhǎng)的EOC細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)水平。 6.利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用單樣本t檢驗(yàn)分析貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)差異,顯著性水平定義α=0.05,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”表示。 結(jié)果： 1.DNA測(cè)序證實(shí)miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒載體和對(duì)照空載體序列均正確。 2.成功生產(chǎn)了miR-200a過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照慢病毒,用以感染EOC細(xì)胞株OVCAR-3,感染后在倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)GFP十細(xì)胞的表達(dá)率約為20%-30%,進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀分選GFP+細(xì)胞,得到感染效率約為95%的EOC細(xì)胞。 3.成功構(gòu)建了miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型。qRT-PCR驗(yàn)證攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,miR-200a的表達(dá)水平升高(3.67±0.45)倍。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,miR-200a的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=10.187,P=0.009)。 4.成功構(gòu)建miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型。qRT-PCR驗(yàn)證攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比,miR-200a的表達(dá)水平升高(2.05±0.39)倍。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,niR-200a的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=4.666,P=0.043)。 結(jié)論： 成功將目的基因miR-200a整合入EOC細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)高效表達(dá),建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-200a的貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型。 第二章MiR-200a對(duì)EOC化療敏感性、增殖及CSCs的調(diào)控作用及其機(jī)制 第一節(jié)MiR-200a對(duì)EOC化療敏感性的調(diào)控作用 目的： 在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-200a的貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞模型中,驗(yàn)證miR-200a對(duì)EOC化療敏感性的調(diào)控作用。 方法： 1.MTT檢測(cè)miR-200a;對(duì)貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞化療敏感性的影響。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,分別重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。按5x103細(xì)胞／孔接種于普通96孔板內(nèi),培養(yǎng)12-16h后,在細(xì)胞中分別加入不同濃度的紫杉醇(終濃度分別為：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM)或順鉑(終濃度分別為：lug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。藥物作用48h后,每孔中加入201μL細(xì)胞活力檢測(cè)試劑MTT(5mg/mL),繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h后,小心棄去細(xì)胞上清液,每孔分別加入100uL DMSO,避光震蕩混勻后,置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值,檢測(cè)波長(zhǎng)490nm。細(xì)胞存活率(SR)按以下公式計(jì)算：加藥孔吸光度平均值／空白對(duì)照組吸光度平均值x100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 2.MTT檢測(cè)miR-200a;對(duì)懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞化療敏感性的影響。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,分別重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按1x104細(xì)胞／孔接種于超低吸附96孔板內(nèi),培養(yǎng)24h后,在細(xì)胞中分別加入不同濃度紫杉醇(終濃度分別為：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM)或順鉑(終濃度分別為：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。藥物作用72h后,每孔中加入20μL細(xì)胞活力檢測(cè)試劑MTT(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h后,箱式離心機(jī)3000rpm離心15min,此時(shí)可見(jiàn)腫瘤球細(xì)胞聚集于孔板的一側(cè),用1mL注射器小心吸棄上清液,每孔分別加入100uLDMSO,避光震蕩混勻后,置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值,檢測(cè)波長(zhǎng)490nm。細(xì)胞存活率(SR)按以下公式計(jì)算：加藥孔吸光度平均值/空白對(duì)照組吸光度平均值x100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 3.利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用析因設(shè)計(jì)的方差分析和兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),分析細(xì)胞毒性試驗(yàn)中細(xì)胞存活率之間的差異。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”表示。 結(jié)果： 1. miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在紫杉醇的終濃度為：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM時(shí),細(xì)胞存活率(%)分別為：(85.86±4.16vs.87.80±2.22),(74.66±3.19vs.80.62±2.60),(65.85±4.24vs.76.15±4.46),(54.91±4.43vs.69.53±3.31),(54.62±1.76vs.66.91±3.41)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,紫杉醇細(xì)胞毒性之間的差異總體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=63.464,P值0.001)。 miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在順鉑的終濃度為：1ug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mLL時(shí),細(xì)胞存活率(%)分別為：(90.24±5.00vs.85.60±3.60),(66.96±3.57vs.71.95±6.68),(62.02±2.57vs.66.46±2.89),(54.45±2.63vs.56.89±2.80),(49.39±4.21vs.46.61±2.75),(43.54±4.34vs.42.38±2.18)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,順鉑細(xì)胞毒性之間的差異總體沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=0.247,P值=0.622)。 2. miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在紫杉醇的終濃度為：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM時(shí),細(xì)胞存活率(%)分別為：(69.27±3.63vs.83.43±4.01),(57.03±2.88vs.78.91±0.86),(57.47±1.31vs.80.89±1.29),(57.69±1.35vs.80.11±1.80),(55.17±0.60vs.77.96±3.75)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,紫杉醇細(xì)胞毒性之間的差異總體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=721.813,P值0.001)。 miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在順鉑的終濃度為：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL時(shí),細(xì)胞存活率(%)分別為：(50.80±2.35vs.54.37±1.86),(42.64±2.80vs.41.71±1.62),(49.66±2.03vs.46.92±6.37),(46.84±7.72vs.51.57±5.25),(42.66±2.98vs.45.54±5.36)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,順鉑細(xì)胞毒性之間的差異總體沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=1.191,P值=0.284)。 結(jié)論： miR-200a過(guò)表達(dá)增加了貼壁和懸浮生長(zhǎng)的EOC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性,沒(méi)有影響貼壁和懸浮生長(zhǎng)的EOC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。 第二節(jié)MiR-200a對(duì)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的調(diào)控作用 目的： miR-200a具有提高貼壁和懸浮生長(zhǎng)的EOC細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的作用,而對(duì)順鉑的敏感性沒(méi)有影響；考慮到紫杉醇是靶向細(xì)胞增殖周期的藥物,而順鉑為非細(xì)胞周期依賴藥物,所以有必要進(jìn)一步探索miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。本部分通過(guò)一系列體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的調(diào)控作用。 方法： 1.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)]miR-200a;對(duì)貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。 收集lniR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,按1.5x102細(xì)胞/孔接種于普通6孔板內(nèi),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)10d,觀察細(xì)胞克隆的形態(tài),計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),棄掉培基,PBS小心漂洗3遍,甲醇固定10min,蘇木素染色5-10min,自來(lái)水小心漂洗后,拍照記錄克隆外觀。計(jì)算克隆形成率=(克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù))x100%。 2.生長(zhǎng)曲線(CCK8法)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)]miR-200a對(duì)貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,按2.0×103細(xì)胞／孔接種于普通96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)6h、1、2、3、4、5、6d時(shí),加入CCK8與培基混合液110μL(比例為1：10),繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)1.5h,以空白對(duì)照孔調(diào)零,置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值,檢測(cè)波長(zhǎng)450nm,以相對(duì)應(yīng)OD值代表細(xì)胞增殖狀態(tài),各組取6孔OD值的平均值,繪制細(xì)胞增殖曲線。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按4.0×103細(xì)胞／孔接種于超低吸附96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d時(shí),加入CCK8液10μL,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h,以空白對(duì)照孔調(diào)零,置酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值,檢測(cè)波長(zhǎng)450nm,以相對(duì)應(yīng)OD值代表細(xì)胞增殖狀態(tài),各組取6孔OD值的平均值,繪制細(xì)胞增殖曲線。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-200對(duì)貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。 分別收集]miR-200a過(guò)表達(dá)及對(duì)照的貼壁和懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞,用預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞兩次,加入預(yù)冷70%乙醇,4℃固定過(guò)夜或-20℃長(zhǎng)期固定,檢測(cè)前PBS漂洗細(xì)胞一次,加入含50μg/mL溴化乙錠(PI)、100μg/mL RNase A、0.2%TritonX-100的PBS500μL,室溫避光孵育30分鐘,以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè),計(jì)數(shù)1～2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析結(jié)果。 4.體內(nèi)驗(yàn)證miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。 選取4-5周齡雌性BALB/c-nu/nu裸鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,分別皮下注射移植入裸鼠背部的右側(cè)及左側(cè),每側(cè)移植1.5x106個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞懸液總體積為100μL。實(shí)驗(yàn)共用8只裸鼠,每3日觀察裸鼠一般情況、測(cè)量接種部位包塊生長(zhǎng)情況并記錄裸鼠體重,依據(jù)移植瘤生長(zhǎng)情況適時(shí)取材并作相關(guān)分析。 5.取移植瘤組織免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá)情況,光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野,計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞比例。陽(yáng)性細(xì)胞比例=每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。 6.利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析平板克隆形成率差異、移植瘤組織中Ki67陽(yáng)性率差異、細(xì)胞周期分布差異。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,分析生長(zhǎng)曲線(CCK8法)及裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)差異,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”表示。 結(jié)果： 1.平板克隆實(shí)驗(yàn)中,miR-200過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞,體積縮小、細(xì)胞排列更緊密,更傾向于上皮細(xì)胞表型；miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成率(%)分別為(92.52±5.60vs.79.12±4.41)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,克隆形成率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=-4.461,P值=0.001)。 2.生長(zhǎng)曲線(CCK8法)實(shí)驗(yàn)中,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在培養(yǎng)8h、1、2、3、4、5、6d時(shí),吸光度值(OD)分別為(0.278±0.008vs.0.275±0.002),(0.500±0.096vs.0.433±0.035),(0.624±0.058vs.0.528±0.046),(1.028±0.115vs.0.710±0.048),(1.530±0.160vs.1.000±0.171),(1.993±0.206vs.1.239±0.159),(2.450±0.233vs.1.428±0.161)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,細(xì)胞增殖的差異總體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=199.507,P值0.001)。 miR-200過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d時(shí),吸光度值(OD)分別為(0.218±0.015vs.0.216±0.013),(0.333±0.013vs.0.323±0.014),(0.462±0.028vs.0.437±0.021),(0.720±0.078vs.0.565±0.050),(0.952±0.081vs.0.688±0.062),(1.149±0.116vs.0.803±0.054),(1.434±0.135vs.0.957±0.080)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,細(xì)胞增殖的差異總體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=159.036,P值0.001)。 3.流式檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中,miR-200過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,G0/G1、S、G2/M期所占比例(%)分別為(55.86±2.55vs.72.41±3.22),(26.15±2.30vs.21.76±2.11),(13.52±1.99vs.6.82±0.76)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差異分別為(t值=9.861,P值0.001)、(t值=-3.445,P值=0.006)、(t值=-7.686,P值0.001),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,Go/G1、S、G2/M期所占比例(%)分別為(69.52±3.24vs.90.48±2.36),(21.35±2.10vs.5.49±0.52),(11.31±1.43vs.3.32±0.28)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差異分別為(t值=11.470,P值0.001)、(t值=-17.926,P值=0.006)、(t值=-13.386,P值0.001),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中,miR-200過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞均能在裸鼠皮下生長(zhǎng)形成腫瘤。miR-200a過(guò)表達(dá)的皮下移植瘤和對(duì)照移植瘤體積(mm3),在皮下接種移植后50、53、56、59、62d分別為(110.27±57.84vs.58.19±19.55),(146.88±73.64vs.67.44±32.58),(167.03±75.68vs.82.25±48.15),(234.01±80.85vs.108.74±42.98),(366.36±99.87vs.137.44±43.13)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,裸鼠皮下移植瘤增長(zhǎng)的差異總體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=63.441,P值0.001)。 5.免疫組化檢測(cè)移植瘤組織中Ki67表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中,miR-200a過(guò)表達(dá)和對(duì)照移植瘤組織中Ki67陽(yáng)性表達(dá)率(%)為(70.91±5.18vs.15.21±3.52)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)和對(duì)照移植瘤組織中,Ki67陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=-25.156,P值0.001)。 結(jié)論： 1.過(guò)表達(dá)miR-200a增加了EOC細(xì)胞平板克隆形成率；促進(jìn)了貼壁及懸浮生長(zhǎng)EOC細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其進(jìn)入增殖周期；有益于EOC細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)；說(shuō)明miR-200a具有促進(jìn)EOC細(xì)胞的增殖的作用。這種促增殖效應(yīng)可能是miR-200a增加EOC細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的作用機(jī)制之一。 第三節(jié)MiR-200a調(diào)控EOC中CSCs的作用及其機(jī)制 目的： 以上研究發(fā)現(xiàn)miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞株紫杉醇敏感性及增殖狀態(tài)具有一定的調(diào)控作用,接下來(lái)我們擬探索miR-200a調(diào)控EOC中CSCs的作用及其機(jī)制。通過(guò)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)、流氏細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群(side population,SP)細(xì)胞比例、檢測(cè)CSCs特性相關(guān)基因表達(dá)水平,驗(yàn)證miR-200a對(duì)EOC中CSCs干性特征的調(diào)控作用及其機(jī)制。 方法： 1.腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞自我更新能力的影響。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按1×103細(xì)胞/孔分別接種于超低吸附24孔板內(nèi),每組三個(gè)復(fù)孔,常規(guī)培養(yǎng)7d,倒置熒光顯微鏡下觀察腫瘤球形態(tài),計(jì)數(shù)直徑≥-70μm的腫瘤球個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 2.流氏細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞比例,驗(yàn)證miR-200a對(duì)EOC中CSCs比例的影響。 收集miR-200a過(guò)表達(dá)的貼壁生長(zhǎng)EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,重懸于已預(yù)熱為37℃含2%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL,每組各準(zhǔn)備兩管細(xì)胞,四管細(xì)胞中均加入Hoeehst33342終濃度為5ug/mL,在每組細(xì)胞中隨機(jī)選擇一管再加入維拉帕米終濃度為50μmol/L,37℃搖床避光孵育90min后放于冰上終止反應(yīng)。4℃1000rpm離心3min,棄上清,預(yù)冷PBS洗滌一次。40μm濾器過(guò)濾待檢測(cè)細(xì)胞,檢測(cè)前加入碘化丙淀(PI)終濃度1μg/mL標(biāo)記死細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP比例,Hoeehst33342激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm,405/30帶通收集藍(lán)光,570/20帶通收集紅光,PI用488nm藍(lán)光激發(fā),630/30帶通收集紅光。去除PI直接染色陽(yáng)性的死細(xì)胞,以Hoechst Red為X軸,Hoechst Blue為Y軸作二維散點(diǎn)圖。設(shè)門(mén)選低Hoechst Red及低Hoechst Blue且維拉帕米組缺失的區(qū)域?yàn)镾P細(xì)胞。比較SP細(xì)胞比例在miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞間的差別。 3. qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)miR-200a對(duì)EOC細(xì)胞中CSCs相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。 qRT-PCR檢測(cè)方法如下,提取miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞總RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA, qRT-PCR檢測(cè)(SYBR法)SOX2和OCT4mRNA水平,以GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。 Western Blot檢測(cè)方法如下,提取miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度,每個(gè)泳道加30μg蛋白樣品,SDS-PAGE將蛋白分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,3%BSA拮抗非特異性位點(diǎn),分別用SOX2和OCT4的一抗(稀釋比例1：1000),4℃孵育過(guò)夜,相應(yīng)二抗室溫孵育1h,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)觀察蛋白印跡,以P-actin作為內(nèi)源性對(duì)照。 4.利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析腫瘤球形成差異、SP細(xì)胞比例差異,單樣本的t檢驗(yàn)分析qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)SOX2和OCT4表達(dá)差異。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”表示。 結(jié)果： 1.腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到有部分miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞,在超低吸附培養(yǎng)皿中亦可貼壁生長(zhǎng),并以貼壁方式逐漸增殖,而對(duì)照組中幾乎沒(méi)有腫瘤球細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象。miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,腫瘤球形成個(gè)數(shù)(/1000個(gè)細(xì)胞)分別為(7.17±1.17vs.17.50±1.87)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,腫瘤球形成個(gè)數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=11.474,P值0.001)。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞比例的實(shí)驗(yàn)中,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞SP細(xì)胞比例(%)為(0.233±0.076vs.0.850±0.100)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞,SP細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=8.488,P值=0.001)。 3. qRT-PCR檢測(cè)miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞中SOX2和OCT4mRNA水平分別下降至對(duì)照細(xì)胞的0.467和0.361倍。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,SOX2和OCT4mRNA水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=-10.932,P=0.008)和(t值=-17.416,P值=0.003)。 Western Blot結(jié)果提示miR-200過(guò)表達(dá)的EOC中細(xì)胞中,SOX2和OCT4蛋白表達(dá)水平分別下降至對(duì)照細(xì)胞的0.546和0.518倍。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示,miR-200a過(guò)表達(dá)的EOC細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞,SOX2和OCT4蛋白水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=-10.191,P值=0.009)和(t值=-9.659,P值=0.011)。 結(jié)論： 過(guò)表達(dá)miR-200a通過(guò)抑制EOC細(xì)胞自我更新能力、誘導(dǎo)分化、降低SP細(xì)胞比例、下調(diào)干性相關(guān)基因SOX2和OCT4的表達(dá),弱化了EOC中CSCs的干性特征。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王偉;王沂峰;張嶺梅;林瓊燕;黃菊;;人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞系中側(cè)群細(xì)胞的分離及其成瘤性、侵襲性的實(shí)驗(yàn)研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年06期

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本文編號(hào)：2408171