本文選題：宮頸癌　切入點：LKB1　出處：《山東大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分LKB1對宮頸癌細胞轉錄譜的影響及抑癌機制研究 宮頸癌是全球范圍內女性第二大常見惡性腫瘤,每年新發(fā)宮頸癌病例大約53萬。盡管在發(fā)達國家隨著篩查方法的改進,宮頸癌的發(fā)病率已經(jīng)降低,但是在發(fā)展中國家,由于社會經(jīng)濟因素,宮頸癌的篩查方法不能廣泛普及,因此宮頸癌仍然是威脅婦女的主要致死因素。 宮頸癌的發(fā)生有病毒方面的因素,高危型人乳頭瘤病毒(High-risk type human papilloma virus, hr-HPV)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關。這一事實提供了預防宮頸癌的方法,即預防接種HPV疫苗阻止感染。盡管HPV疫苗已經(jīng)上市,但是對于已經(jīng)感染HPV或者患有免疫抑制的病人沒有效果。 HPV是一類無包膜的小DNA病毒,可以在表皮和粘膜上皮細胞復制增殖。根據(jù)HPV的臨床意義,可將其分為高危和低危型。持久的高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要致病因子。全球大約70%的宮頸癌由HPV16,18型引起。高危型HPVs的兩個癌蛋白E6和E7具有促進細胞增殖的作用,在宮頸癌的惡性轉化過程中起重要作用。E6、E7分別與抑癌蛋白p53和pRb相互作用,促進它們的降解誘發(fā)腫瘤發(fā)生。盡管HPVs在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用,但是只有一小部分感染了高危型HPVs的女性最終發(fā)展為宮頸癌,而且從最初感染HPVs到最終進展為宮頸癌,這一過程需要幾十年的時間,提示高危型HPVs的感染對于宮頸的癌變是必要的但不是充分的條件。此外,有些宮頸癌檢測不到HPVs。因此,在宮頸的癌變過程中,一定有一些其它協(xié)同因子或遺傳事件參與其中。 肝激酶B1(liver kinaseB1,LKB1)又稱絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine threonine kinase, STK11),最初在黑斑息肉綜合征(Peutz-Jeghers syndrome, PJS)研究發(fā)現(xiàn),LKB1基因突變是導致PJS發(fā)生的因素,PJS患者對胃腸道腫瘤,乳腺腫瘤,婦產(chǎn)腫瘤的易感性增加。繼而在散發(fā)性腫瘤中,也發(fā)現(xiàn)了LKB1基因的體細胞突變,如非小細胞肺癌、結腸癌、乳腺癌和宮頸癌等,因而LKB1已作為一個比較公認的抑癌基因被廣泛研究。LKB1抑癌的分子機制目前尚不十分清楚,現(xiàn)有的研究表明,LKB1是一種重要的上游蛋白激酶,LKB1與偽激酶STRAD和清道夫蛋白M025形成功能三聚體,這個復合體可以磷酸化至少14種在T環(huán)活化位點具有保守蘇氨酸的絲氨酸-蘇氨酸激酶,而使之激活。個研究非常多的LKB1底物是AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK),AMPK是細胞、機體代謝的主要調節(jié)劑,LKB1可通過AMPK對外界各種生理病理刺激作出反應,例如：骨骼肌收縮,低氧,饑餓,H202,二甲雙胍和苯乙雙胍等。重要的是,LKB1通過激活AMPK調節(jié)細胞生長和細胞周期,活化的AMPK激活TSC2復合體和nTOR伴侶分子raptor,進而負向調控nTOR信號通路,抑制細胞生長。此外,LKB1參與調控細胞極性,細胞增殖,細胞遷移,細胞衰老,凋亡,DNA損傷反應,細胞分化和有氧糖酵解過程等,也與其抑制腫瘤發(fā)生的機制有關。 LKB1基因突變在宮頸癌中的研究最早始于1999年,根據(jù)不同的文獻報道,宮頸癌中LKB1基因突變率在2-20%,但有關宮頸癌組織中LKB1蛋白表達狀況的報道尚很少。 目前,宮頸癌細胞中LKB1抑制細胞增殖的分子機制研究主要集中于LKB1/AMPK通路。已有文獻報道,在宮頸癌細胞HeLa、SiHa中過表達LKB1可以抑制其生長,且依賴于LKB1的激酶活性；LKB1可抑制HeLa細胞的錨定非依賴性生長,但對SiHa細胞沒有此作用；應用AMPK激活劑(如AICAR、二甲雙胍等)對于具有LKB1/AMPK/mTOR完整信號通路的宮頸癌細胞系有抑制作用。但是,LKB1抑癌分子機制的研究尚存在許多的未知,LKB1是否可調控更多的下游基因?是否有新的通路參與其抑癌作用機制?LKB1在宮頸正常組織及癌組織中的蛋白表達及功能?這些都是尚待解決的問題。深入研究LKB1的抑癌分子機制將有助于發(fā)現(xiàn)更多的關鍵分子,為治療干預宮頸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的思路和靶標。 基于LKB1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的潛在重要作用,本研究在宮頸癌細胞中初步研究了LKB1的生物學活性,并對臨床宮頸癌組織中LKB1蛋白的表達狀況進行了檢測。重要的是,我們首次利用基因芯片Microarray技術研究了LKB1對宮頸癌細胞基因轉錄譜的影響,通過生物信息學對差異表達基因進行了分析,繼而在mRNA和蛋白水平給予驗證。其中,在磷脂酰肌醇(PI3K)信號通路中,我們發(fā)現(xiàn)II型四磷酸肌醇磷酸酶(Inositol polyphosphate4-phosphatase type II, INPP4B)基因的表達在LKB1過表達后明顯上調,進一步的細胞學實驗進一步證明INPP4B是LKB1重要的下游靶分子。INPP4B也是一種潛在的腫瘤抑制因子,LKB1對INPP4B表達的調控作用尚未見報道。 一.LKB1表達對宮頸癌細胞增殖的影響 為檢測LKB1蛋白表達對宮頸癌細胞增殖的影響,我們將編碼LKB1的質粒成功轉染了HeLa細胞(LKB1表達缺失)并經(jīng)歷短期G418篩選,Western blot檢測此細胞中有明顯的LKB1蛋白表達。進一步采用CCK-8方法檢測細胞的增殖活性,結果顯示,過表達LKB1的HeLa細胞增殖能力顯著低于載體對照組。采用BrdU實驗檢測了細胞周期改變,結果發(fā)現(xiàn)HeLa細胞過表達LKB1后,位于S期的細胞數(shù)目顯著降低,DNA復制合成減少,表明細胞生長增殖能力下降。以上結果說明LKB1蛋白抑制宮頸癌細胞HeLa的生長增殖。LKB1穩(wěn)轉細胞系HeLa-LKB1的研究結果表明：LKB1蛋白在穩(wěn)轉細胞系中有效表達,而且可檢測至p-AMPK磷酸化水平的升高,說明在HeLa-LKB1細胞中LKB1可磷酸化其下游的MPK使其活化,LKB1具有活性,且LKB1-AMPK的信號通路是完整的。 二.LKB1蛋白在宮頸癌組織中的表達 為探究LKB1蛋白在臨床宮頸癌組織中的表達狀況,我們對78例宮頸癌(包括25例宮頸腺癌、53例宮頸鱗癌)和25例正常宮頸組織進行了免疫組化檢測。結果表明,在44%(11/25)的宮頸腺癌、60.4%(32/53)的宮頸鱗癌組織中LKB1蛋白表達缺失。以上結果說明,宮頸癌組織中LKB1蛋白表達有較高的缺失率,這與公認的LKB1是一個抑癌基因一致。檢測結果發(fā)現(xiàn)在正常宮頸組織中存在LKB1表達弱陽性或不表達,這與文獻中報道的正常結直腸、胰腺組織LKB1的表達情況類似。 三.LKBl轉錄譜的研究以及LKB1的新靶標INPP4B的發(fā)現(xiàn) 盡管已知LKB1可以調控至少14種下游激酶,但是LKB1的作用機制仍然沒有完全清楚,為探究宮頸癌細胞中受LKB1調控的基因,我們進行了Microarray基因芯片水平的轉錄譜研究。通過Microarray實驗,在穩(wěn)定表達LKB1蛋白的HeLa細胞系中,我們識別了222個LKB1調控的差異表達基因,其中下調的基因有117個,上調的基因有105個。qRT-PCR技術對七個差異表達基因LKB1、PLK2、ABCC2、GLP2R、KYNU、MAL2和AKAP12進行了mRNA水平的驗證,結果證實Microarray數(shù)據(jù)真實反映了基因在轉錄水平的變化。 生物信息學方法進一步分析差異表達基因�；虮倔w方法(gene ontology,GO)對差異表達基因進行了分類,GO數(shù)據(jù)庫分為生物學過程分類,分子功能分類以及細胞組分分類。分析結果顯示,222個差異表達基因可歸屬在40個生物學過程分類,23個分子功能分類以及20個細胞組分分類中。LKB1調控的基因多參與信號轉導,蛋白間相互作用以及定位于膜上。KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫對差異表達基因的分析發(fā)現(xiàn)了8個有統(tǒng)計學意義的生物學通路。其中兩條通路是與代謝有關,分別是精氨酸和脯氨酸代謝通路、肌醇磷酸代謝通路,這與LKB1參與代謝的觀點一致。另外一條重要的信號通路是磷脂酰肌醇(PI3K)信號通路,有文獻報道LKB1-AMPK信號通路可與PI3K-Akt信號通路匯合在mTOR,參與調控細胞的生長與代謝。另外LKB1還參與了軸突發(fā)育通路和造血干細胞系分化通路。 在PI3K信號通路中的分析中我們發(fā)現(xiàn)一個重要的磷酸肌醇磷酸酶INPP4B基因的表達在LKB1過表達后明顯上調。采用qRT-PCR進一步證實在過表達LKB1的HeLa中INPP4B mRNA水平顯著增加。Western blot結果表明：LKB1穩(wěn)轉HeLa細胞中INPP4B蛋白水平升高1.4倍,同時在瞬轉LKB1且經(jīng)歷G418短期篩選的HeLa細胞中INPP4B蛋白水平升高1.9倍。進一步采用特異性siRNA,在表達LKB1且LKB1-AMPK通路完整的宮頸癌CaSki細胞中敲低LKB1, Western blot檢測INPP4B的表達變化,發(fā)現(xiàn)敲低LKB1后,INPP4B蛋白表達水平也隨之降低。我們進一步檢測了LKB1穩(wěn)轉HeLa細胞系中p-Akt水平改變,結果表明,與空載對照細胞HeLa-vetor相比,HeLa-LKB1細胞中Akt磷酸化水平明顯下降。以上結果證明,抑癌蛋白LKB1可正向調控INPP4B的表達,INPP4B是LKB1下游的一個新靶蛋白。在過表達LKB1的HeLa細胞系中INPP4B表達上調,而磷酸化Akt水平下降,提示LKB1通過上調INPP4B參與了PI3K/Akt通路的負向調控,這可能是LKB1抑制細胞增殖的一個新通路。 綜上所述,本研究探討了抑癌蛋白LKB1在宮頸癌中的作用；并首次應用Microarray技術對表達LKB1的宮頸癌細胞進行了基因轉錄譜分析,進一步對發(fā)現(xiàn)的新靶標INPP4B進行了初步研究。研究證實,過表達LKB1對宮頸癌細胞生長增殖有抑制作用,在超過50%的宮頸癌組織中LKB1蛋白表達缺失,說明LKB1的抑癌活性在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。基于Microarray分析我們識別了222個受LKB1調控的基因,發(fā)現(xiàn)了8個有統(tǒng)計學意義的生物學通路。在PI3K信號通路中一個重要的抑癌基因INPP4B在LKB1過表達后明顯上調,細胞學實驗進一步證明INPP4B是LKB1下游的一個新靶標。在過表達LKB1的HeLa細胞系中INPP4B上調,而磷酸化Akt水平下降,提示LKB1通過上調INPP4B參與了P13K/Akt通路的負向調控,這可能是LKB1抑制細胞增殖的一個新通路。以上發(fā)現(xiàn)為深入研究LKB1調控的分子信號通路奠定了實驗基礎,為宮頸癌的治療干預提供了新的分子靶標。第二部分CIP2A調控宮頸腺癌多藥耐藥的研究 宮頸癌是世界范圍內最常見的婦科腫瘤疾病之一,嚴重威脅女性的身體健康,死亡率位居發(fā)展中國家女性腫瘤的第二位。近年來,全球宮頸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢。流行病學研究結果表明,高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是婦女宮頸癌和宮頸上皮內瘤變的高危因素。 雖然宮頸癌篩查方法的普及和HPV預防性疫苗的出現(xiàn)有效降低了全球宮頸癌的發(fā)病率。然而,在發(fā)展中國家宮頸癌仍然是影響和威脅女性健康的重要因素。手術和放療是宮頸癌的主要治療方法,早期以手術治療為主,中晚期多采用放射治療。過去,一直認為宮頸癌屬于化療不敏感的腫瘤,僅在晚期及復發(fā)的患者中將化療作為綜合治療的一部分。近年來,國內外學者對化療在宮頸癌中的應用進行了大量的基礎和臨床研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)化療后患者5年生存率明顯提高,因此確立了化療在宮頸癌治療中的重要地位�；煹膬�(yōu)勢在于可以治療腫瘤周圍肉眼看不見的微小轉移灶以及可能存在的全身亞臨床轉移和復發(fā)的病人。近10年來對宮頸癌的綜合治療日益受到關注,綜合治療已成為現(xiàn)代治療宮頸癌的一個重要策略。 然而,盡管人們已經(jīng)認識到化療在宮頸癌中的作用,并且已經(jīng)將化療作為宮頸癌治療的重要手段,但是宮頸癌多藥耐藥的產(chǎn)生卻大大限制了化療藥物的療效和應用,導致治療失敗,腫瘤復發(fā)。宮頸癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥的機制分為兩大類：①對天然化療藥物的耐藥機制,主要包括P糖蛋白的過度表達及DNA拓撲異構酶酶含量與活性的改變；②對鉑類化合物和烷化劑耐藥的機制,主要包括藥物在細胞內積聚減少,巰基化合物(GSH、GST、MT)對藥物的解毒力增加,DNA損傷修復能力增加等。 P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是一種跨膜糖蛋白,由多藥耐藥基因(MDR1)編碼。P糖蛋白是ABC轉運蛋白家族的一員,通過與抗癌藥物結合后再與ATP結合,經(jīng)ATP供能將細胞內藥物逆濃度梯度運出胞外,使細胞內藥物濃度不斷下降從而使之達不到有效殺傷濃度,最終導致腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生。在使用天然化療藥物后,幾乎50%的腫瘤都有P-gp蛋白的表達增加。宮頸癌的耐藥問題也與P-gp的表達增加密切相關。 Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A (CIP2A)是一種2007年發(fā)現(xiàn)的癌蛋白,CIP2A可抑制PP2A對c-Myc62位絲氨酸(S62)的去磷酸化,從而增加細胞中c-Myc的蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn),CIP2A在很多人類惡性腫瘤中過表達,例如胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、急性白血病、前列腺癌、宮頸癌等。CIP2A還可以促進細胞的惡性生長增殖,并與化療藥物導致肝細胞癌、乳腺癌、白血病細胞的凋亡有關。那么,CIP2A是否也和宮頸癌的耐藥性相關?進而是否參與了宮頸癌多藥耐藥機制的產(chǎn)生?CIP2A在宮頸癌中與P-gp蛋白的表達有無關聯(lián)?這些問題是我們此項研究的重點。 一.敲低CIP2A提高了宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性 我們在宮頸腺癌細胞系HeLa中特異性敲除CIP2A后,使用臨床常用的三種腫瘤化療藥物多柔比星(Dox)、順鉑(Cis)和紫杉醇(Pac)處理細胞,通過MTT實驗觀察藥物對HeLa細胞的殺傷作用。 實驗結果顯示,多柔比星(Dox)、順鉑(Cis)和紫杉醇(Pac)三種化療藥物抑制HeLa細胞增殖,在特異性敲低CIP2A后,三種化療藥物對HeLa細胞增殖的抑制能力顯著增加。這表明,在HeLa細胞中CIP2A與化療藥物療效有關,敲低CIP2A能夠提高HeLa細胞對化療藥物的敏感性,因此本部分實驗提示CIP2A可能參與腫瘤的多藥耐藥(MDR)。二. CIP2A和P-gp蛋白的表達在宮頸癌組織中密切相關 我們在山東大學齊魯醫(yī)院收集了103例石蠟包埋組織塊,其中包括15例正常宮頸組織、16例CIN I、17例CIN II、12例CIN III、43例宮頸腺癌,利用免疫組化技術檢測CIP2A和P-gp的蛋白表達情況。實驗結果顯示CIP2A和P-gp在15例正常組織、16例CIN I、17例CIN II組織中均不表達；12例CIN III組織中有1例(8.3%)CIP2A陽性,在43例宮頸腺癌組織中有16例(37.2%)有CIP2A的表達；P-gp在12例CIN III組織中表達陰性,在43例宮頸腺癌組織中有13例(30.2%)有P-gp的表達。CIP2A主要表達于胞漿,而P-gp主要位于細胞膜上。免疫組化結果顯示,CIP2A和P-gp的表達在同一個宮頸癌標本上強度一致。并且統(tǒng)計學分析顯示在宮頸腺癌組織中,CIP2A和P-gp表達正相關((r2=0.617,p0.001)),P-gp表達和病人年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤淋巴結轉移、淋巴轉移無相關性,但與腫瘤分化成度有關(p=0.029)。以上結果顯示,在宮頸腺癌組織標本中,CIP2A和P-gp表達成正相關。三. CIP2A通過調控P-gp蛋白影響宮頸癌的多藥耐藥 為了進一步驗證CIP2A與P-gp蛋白之間的關系,我們進行了如下實驗：多柔比星(Dox)、順鉑(Cis)和紫杉醇(Pac)三種化療藥物處理HeLa細胞,檢測化療藥物作用后CIP2A與P-gp蛋白的表達水平；同時檢測抗Dox HeLa細胞系HeLa/Dox中CIP2A與P-gp蛋白的表達水平,同時在該細胞系中特異敲低CIP2A后,檢測P-gp蛋白的水平變化；在HeLa、HeLa/Dox細胞系中特異性敲低CIP2A后,羅丹明外排實驗檢測P-gp蛋白的功能。 研究結果顯示,化療藥物處理HeLa細胞后,CIP2A與P-gp蛋白的表達水平均明顯上升；耐藥細胞系HeLa/Dox中CIP2A與P-gp蛋白的表達水平較HeLa細胞顯著增高,在干擾CIP2A后,P-gp蛋白的表達水平隨之降低；在HeLa、 HeLa/Dox細胞系干擾CIP2A后,羅丹明外排實驗結果顯示細胞內熒光信號顯著增強,表明P-gp蛋白的藥物外排功能受到抑制。上述結果提示,CIP2A通過P-gp蛋白實現(xiàn)對宮頸腺癌耐藥的調控。 綜上,本研究利用體內外實驗首次驗證了CIP2A參與宮頸腺癌多藥耐藥的形成,這種作用主要是CIP2A通過上調P-gp蛋白的表達來實現(xiàn)的。在宮頸腺癌組織中CIP2A和P-gp蛋白的表達呈正相關；敲低CIP2A可提高宮頸腺癌細胞對多種化療藥物的敏感性,P-gp蛋白的表達水平也隨之降低。因此,我們的研究結果提示,CIP2A作為一個新的基因治療靶標,在宮頸腺癌的綜合治療中有著潛在的應用前景。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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1 王玲;劉世坤;;腫瘤多藥耐藥機制的研究進展[J];右江醫(yī)學;2006年03期

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本文編號：1594824