本文關鍵詞：新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中的作用及其分子機制

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【摘要】：圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是導致兒童殘疾的最重要的疾病。因此缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的機制研究已成為當今醫(yī)學研究的重要課題之一。其發(fā)病機制主要包括有興奮性氨基酸中毒、氧自由基、鈣超載、免疫炎癥反應等。雖然有關缺血性腦細胞死亡的興奮性毒性和氧化脅迫以及細胞凋亡方面的研究已經(jīng)取得一定進展,但HIE的臨床治療效果仍不理想。近年來腦缺氧缺血再灌注導致的炎癥免疫損傷機制日益受到人們的關注。由缺氧缺血再灌注誘導的過度炎癥反應是導致腦組織損傷的主要原因之一。Tim-3 (T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)是一種新型免疫調(diào)節(jié)因子,已被發(fā)現(xiàn)表達于多種免疫細胞上,在固有免疫和適應性免疫中均發(fā)揮重要得調(diào)節(jié)作用。表達于Th1細胞表面的Tim-3與其配體galectin-9一起,可抑制免疫反應,誘導Th1細胞凋亡。Tim-3與巨噬細胞M1/M2的極化、移植免疫耐受、腫瘤免疫反應等多種免疫調(diào)節(jié)過程相關。Tim-3在免疫炎癥相關疾病中已顯示出潛在的治療作用,但有關其在HIBD中作用及機制的研究尚屬首次。本研究利用動物模型和體外細胞模型,通過正反雙向論證,對Tim-3在圍產(chǎn)期HIBD中的作用進行系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)：1、缺氧缺血刺激促進腦內(nèi)Tim-3表達顯著升高,并主要集中于活化的小膠質(zhì)細胞。給予新生小鼠缺氧缺血刺激,通過病理組織學分析、凋亡檢測等方法判斷神經(jīng)元損傷程度；利用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學染色及激光共聚焦技術檢測腦內(nèi)Tim-3的表達及細胞定位。結果顯示,HIBD組小鼠腦內(nèi)缺血敏感區(qū)Tim-3表達顯著上調(diào),活化小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)Tim-3的主要來源。2、Tim-3對小膠質(zhì)細胞功能的調(diào)控機制研究。本研究分別利用Tim-3過表達質(zhì)粒及小干擾RNA在BV2細胞系上構建Tim-3過表達、敲減、阻斷模型,研究Tim-3對缺氧缺血再復灌介導的小膠質(zhì)細胞分泌炎性細胞因子及NO功能的影響。研究發(fā)現(xiàn),Tim-3可通過NF-κ B途徑,增強小膠質(zhì)細胞中TNF-α,IL-1β等促炎因子及iNOS的表達,介導缺氧缺血再灌注后腦內(nèi)的炎癥反應。3、特異性阻斷Tim-3的作用可對HIBD損傷神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。我們利用Tim-3阻斷性抗體及Tim-3mut小鼠特異性阻斷Tim-3的作用,通過病理組織學分析、凋亡檢測等方法判斷神經(jīng)元損傷程度；利用水迷宮及曠場實驗,檢測小鼠運動及空間學習記憶能力。研究發(fā)現(xiàn),特異性阻斷Tim-3的作用可顯著減輕缺氧缺血刺激后小鼠腦內(nèi)的炎癥反應,對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。本研究的實施與完成,首次揭示新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中的作用及其分子機制,為新生兒缺氧缺血性腦病的病理機制研究及臨床治療策略提供了新的思路,具有重要的理論研究及臨床應用價值。研究目的：本研究利用HIBD動物模型和體外細胞模型,以缺氧缺血再灌注過程中,激活的腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞為研究對象,探討該病理過程中Tim-3的表達,及其對小膠質(zhì)細胞功能的調(diào)節(jié),深入探討Tim-3在缺氧缺血誘導的腦內(nèi)炎癥反應及缺血缺氧敏感神經(jīng)元死亡中發(fā)揮的作用及其分子機制。研究方法：1、Tim-3表達與HIBD損傷程度相關性研究：1) HIBD動物模型構建方法：新生7天C57小鼠結扎右側頸總動脈,8%氧氣環(huán)境下缺氧1.5小時,3大后灌流取腦。2) Western Blot、RT-PCR、免疫熒光方法檢測HIBD動物模型中Tim-3表達。3) RT-PCR方法檢測HIBD動物模型中TNF-α等細胞因子及iNOS表達量。4) HE、TUNEL方法檢測腦損傷程度。2、Tim-3對小膠質(zhì)細胞調(diào)控機制的研究：2. 1、OGD/R刺激BV2細胞后Tim-3的表達及細胞因子的分泌：1) OGD/R模型構建：給予BV2細胞不含葡萄糖和血清的1640培養(yǎng)基,1%氧氣環(huán)境下培養(yǎng)3h,更換正常培養(yǎng)基,在正常培養(yǎng)條件下復氧36h。2) Western Blot、RT-PCR、免疫熒光方法檢測Tim-3表達。3) RT-PCR方法檢測TNF-α等細胞因子及iNOS表達量。2.2、Tim-3對BV2分泌細胞因子的影響：1)構建BV2細胞Tim-3過表達、敲減及抗體阻斷模型,給予OGD/R刺激。2) RT-PCR方法檢測TNF-α等細胞因子及iNOS表達量。3) ELISA檢測細胞上清中TNF-α等細胞因子及NO含量。2.3、Tim-3下游部分信號通路：構建BV2細胞Tim-3過表達、敲減模型,給予OGD/R刺激,Western Blot檢測Tim-3下游信號通路相關蛋白的表達。3、阻斷Tim-3對HIBD損傷神經(jīng)元的保護作用：1) HIBD模型構建成功后,給予Tim-3阻斷抗體5mg/kg腹腔注射,連續(xù)3天,對照組給予同型IgG抗體。同時應用Tim-3mut小鼠構建動物模型。3天后灌流取腦。2) TUNEL方法檢測小鼠腦損傷程度。3) RT-PCR方法檢測小鼠腦內(nèi)TNF-α等細胞因子及iNOS表達量。4) Tim-3mut組小鼠及其對照組野生型小鼠構建HIBD模型,飼養(yǎng)到4周,進行水迷宮及曠場實驗,檢測小鼠運動及空間學習記憶能力。研究結果：1、Tim-3表達與HIBD損傷程度相關性研究：1)HIBD動物缺血側腦內(nèi)大腦皮層、海馬及紋狀體等缺血敏感區(qū)Tim-3表達升高,炎性細胞因子及iNOS的mRNA表達量也均升高。2)Tim-3陽性細胞與CDllb陽性細胞幾乎完全重合,提示HIBD動物模型中,Tim-3主要來源于活化的小膠質(zhì)細胞。2、Tim-3對小膠質(zhì)細胞調(diào)控機制的研究：1)在BV2細胞Tim-3過表達、敲減及抗體阻斷模型中,TNF-α等炎性細胞因子及NO的分泌量隨Tim-3表達量改變而改變。2) NF-κB磷酸化程度隨Tim-3表達量改變而改變。3、阻斷Tim-3對HIBD損傷神經(jīng)元的保護作用：1)給予Tim-3阻斷抗體或應用Tim-3敲基因鼠構建HIBD模型后,小鼠腦內(nèi)缺血敏感區(qū)TUNEL陽性細胞明顯減少。2)給予Tim-3阻斷抗體或應用Tim-3敲基因鼠構建HIBD模型后,小鼠腦組織中TNF-α等炎性細胞因子及iNOS的mRNA表達量降低。3) Tim-3mu組小鼠學習記憶能力較野生型小鼠顯著提高。結論：1、在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中,缺血敏感區(qū)如大腦皮層、海馬及紋狀體區(qū)Tim-3的表達增加,可能是導致選擇性神經(jīng)元凋亡的重要原因之一。2、活化的小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)Tim-3的主要來源。Tim-3可通過NF-κB途徑,增強小膠質(zhì)細胞中TNF-α, IL-1β等促炎因子及iNOS的表達,介導缺氧缺血再灌注后腦內(nèi)的炎癥反應。3、特異性阻斷Tim-3的作用后,對圍產(chǎn)期缺血缺氧再灌注損傷神經(jīng)元可產(chǎn)生保護作用。
【關鍵詞】：圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy HIE) 缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage HIBD) Tim-3(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3) 小膠質(zhì)細胞
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.7
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號說明17-18
• 前言18-26
• 一、圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病18-20
• 二、HIE中小膠質(zhì)細胞的作用20-21
• 三、新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3及其作用21-26
• 第一部分 Tim-3在HIBD動物模型中的表達及定位26-41
• 1、技術路線26
• 2、材料26-28
• 3、方法28-32
• 4、結果32-37
• 5、討論37-39
• 6、結論39-41
• 第二部分 Tim-3對小膠質(zhì)細胞調(diào)控機制的研究41-55
• 1、技術路線41
• 2、方法41-46
• 3、結果46-52
• 4、討論52-54
• 5、結論54-55
• 第三部分 阻斷Tim-3對HIBD損傷神經(jīng)元的保護作用55-65
• 1、技術路線55
• 2、方法55-57
• 3、結果57-62
• 4、討論62-64
• 5、結論64-65
• 參考文獻65-70
• 碩士期間發(fā)表論文70
• 致謝70-71
• 學位論文評閱及答辯情況表71

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