【摘要】：第一部分載笑氣微泡造影劑的制備及性能檢測 目的制備一種包裹笑氣的超聲脂質微泡造影劑（N2O-LM），選用脂質作為外殼材料，全氟丙烷(C3F8)和笑氣（N2O）為內核，檢測該脂質微泡造影劑的基本特性和體內外顯影效果，為后續(xù)的體內體外研究奠定基礎。 方法（1）采用機械振蕩法制備包裹笑氣的脂質微泡,以DSPC、DPPE脂質體為外殼材料，C3F8和N2O為內核；（2）造影劑制備后即刻用水復溶觀察其形態(tài)，檢測平均粒徑及濃度，并分別于4℃冰箱放置6h、1d、3d、1w后復溶，觀察其基本特性改變情況；(3)用馬爾文激光檢測儀檢測各組微泡制備后不同時間（1d、3d、7d）的粒徑大小，Zeta表面電位檢測儀檢測脂質微泡電位，同時各留取部分存放于4℃冰箱中，1周后再次測量其粒徑、電位；（4）觀察60Co輻照后，N2O-LM的形態(tài)、大小、濃度、Zeta電位的變化；（5）制備體外凝膠成像模型，觀察微泡體外增強超聲成像的效果，探討其作為造影顯像劑的可行性，并于體內實驗觀察微泡對兔肝臟顯像效果，了解微泡顯像的原理及能力。 結果本方法成功制備載笑氣脂質微泡（N2O-LM），將其封裝于西林瓶中，肉眼觀察其呈白色凝乳狀，表面不透明且黏稠；光鏡下觀察：微泡數量較多、形態(tài)好，呈類圓形，大小分布較均勻，無明顯聚集現象。微泡濃度約為（3.35±0.31）×109/ml，平均粒徑約為（1105.7±121.2）nm，Zeta電位為（-18.7±2.65）mV。N2O-LM造影劑復溶后1d內微泡能保持較高濃度，造影劑放置3天、1周后復溶，呈白色乳液，理化性質無顯著變化（P＞0.05）；60Co輻照N2O-LM后，微泡形態(tài)大小、濃度、Zeta電位無明顯變化（P＞0.05）。體外超聲顯像示微泡呈高回聲，回聲強度隨濃度減小而降低。 結論本組實驗成功制備了以DSPC、DPPE為外殼材料，全氟丙烷(C3F8)和笑氣（N2O）為內核的脂質微泡造影劑，微泡形態(tài)規(guī)則、呈球形，大小及粒徑較均勻，性質較穩(wěn)定，濃度高，7天內理化性質無明顯變化。N2O-LM具有體內外增強超聲顯像的能力，具備成為超聲對比劑的潛能；體內實驗中，N2O-LM能有效增強兔肝臟顯像，對實質性臟器具有一定的應用價值，值得深入研究。 第二部分N2O-LM聯合聚焦超聲對大鼠骨肉瘤細胞UMR-106生物學效應的研究 目的探討載笑氣微泡（N2O-LM）聯合聚焦超聲（focusultrasound）作用于大鼠骨肉瘤細胞UMR-106所致生物學效應的機制。 方法采用MTT法檢測單純超聲輻照不同時間(10s、20s、30s、60s、90s)對大鼠骨肉瘤細胞UMR-106存活率的影響，以確定最佳輻照時間，聚焦超聲頻率為10.50MHz、聲強為0.5W/cm2。將大鼠骨肉瘤細胞UMR-106懸液分為：對照組、單純N2O組、單純focus ultrasound組、focus ultrasound+C3F8-LM組、focus ultrasound+N2O-LM組，N2O-LM：50ul，C3F8-LM：50ul，AnnexinⅤ/PI染色后經流式細胞計數檢測其死亡方式，用MTT法檢測各組細胞的存活率；結晶紫染色實驗觀察各處理組細胞增殖情況。選擇focus ultrasound參數（超聲頻率10.50MHz、聲強：0.5W/cm2、輻照時間：20秒），采用MTT法檢測聚焦超聲輻照后12h、24h、36h、48h大鼠骨肉瘤細胞UMR-106的存活率，使用流式細胞儀檢測細胞死亡率，hoechst33258核染色法檢測細胞凋亡情況。 結果聚焦超聲（focus ultrasound）分別輻照30s、60s及90s，對大鼠骨肉瘤細胞UMR-106的存活率有明顯降低作用（P＜0.05）；當輻照時間為20s時，對UMR-106細胞存活率無明顯影響（P＞0.05），為最佳輻照時間；單純笑氣對UMR-106細胞存活率無明顯影響（P＞0.05）；當輻照時間為20s、N2O-LM50ul時，N2O-LM聯合focus ultrasound組細胞存活率明顯下降（P＜0.05），AnnexinⅤ/PI染色檢測顯示UMR-106細胞存在壞死與凋亡，透射電鏡顯示超聲處理后細胞胞漿內形成大小不等的空泡，核周間隙明顯增大，胞膜破裂,染色質邊集，并可見核碎裂及核溶解等改變。 MTT檢測顯示focus ultrasound+N2O-LM細胞存活率分別為93.18%(10s),80.28%(20s),70.68%(30s),55.38%（60s） and40.01%(90s)；focus ultrasound+N2O-LM組與對照組、單純N2O組、單純focus ultrasound組、focus ultrasound+C3F8-LM組在同一時間段內比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。流式細胞計數結果顯示focusultrasound+N2O-LM處理組細胞死亡率與其余各組相比有顯著差異（P＜0.05）；hoechst33258細胞核染色顯示細胞凋亡明顯增多，20%細胞出現核濃縮和絮狀改變，核邊集。 結論N2O-LM聯合focus ultrasound對體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤細胞UMR-106具有顯著殺傷作用，能顯著抑制大鼠骨肉瘤細胞UMR-106的增殖活性，N2O可能是一種潛在的氣體聲敏劑，有望為骨肉瘤治療提供新的手段。 第三部分N2O-LM增效HIFU消融離體牛肝的實驗研究 目的觀察自制N2O-LM聯合HIFU消融離體牛肝效果，驗證其作為HIFU增效劑的可行性，探討N2O-LM用于HIFU增效的最適劑量及最佳輻照參數，為下一步體內增效HIFU消融腫瘤提供實驗依據。并探討N2O-LM做為HIFU增效劑的應用價值。 方法取新鮮離體牛肝，，局部分別注射不同比例（PBS與N2O-LM配比分別為5:1,10:1,20:1）包裹笑氣的微泡造影劑，給予不同輸出聲功率、不同時間的HIFU輻照，通過計算輻照區(qū)灰度變化值及凝固性壞死體積評價N2O-LM聯合HIFU消融效果，同時與分別注射PBS液、N2O溶液及C3F8-LM組作對照；HIFU輻照結束后，用以上評價指標評估N2O-LM的體外增效作用。 結果離體牛肝組織局部注射包裹笑氣的脂質微泡后經HIFU輻照，對牛肝組織有顯著的消融作用，輻照區(qū)灰度變化值及凝固性壞死體積均較注射PBS液、C3F8-LM組明顯增大（P0.05）。 結論N2O-LM能縮短HIFU消融時間，減小HIFU消融功率，能有效增強HIFU消融離體牛肝的生物學效應，是一種良好的HIFU增效劑。 第四部分N2O-LM增效HIFU消融大鼠骨肉瘤的實驗研究 目的觀察N2O-LM聯合HIFU消融SD大鼠骨肉瘤細胞UMR-106移植瘤的抑制效應，探討其作為HIFU增效劑的應用價值。 方法進一步建立大鼠骨肉瘤細胞UMR-106的SD大鼠移植瘤模型30只，于腫瘤接種后14d，隨機分為5組：A組（空白對照組），不輻照，不注射微泡亦不加笑氣（N2O），B組（單純N2O組）在輻照前經瘤內注射1ml溶于生理鹽水中的笑氣，C組（單純HIFU組）行單純HIFU輻照，D組（HIFU+C3F8-LM組）瘤內注射稀釋10倍的C3F8-LM乳液1ml，E組（HIFU+N2O-LM組）注射稀釋10倍的N2O-LM乳液1.0ml，以上各組注射完畢后用HIFU定點輻照，輻照聲功率180W，輻照時間5s。HIFU輻照結束后，觀測靶區(qū)灰度變化值及凝固性壞死體積，采集標本行HE染色，增殖細胞核抗原（PCNA）檢測及透射電鏡觀察。處理后觀察其腫瘤體積改變,觀察N2O-LM對大鼠骨肉瘤細胞UMR-106實體瘤的抑制效應。石臘包埋腫瘤組織并切片,HE染色觀察其形態(tài)學改變,進行免疫組化染色、分析PCNA的表達情況,探討其抑制骨肉瘤生長的機制。 結果HIFU聯合載笑氣脂質微泡（N2O-LM）消融大鼠骨肉瘤實驗中，腫瘤消融區(qū)灰度變化值明顯增加，組織凝固性壞死體積亦明顯增加（P0.05），骨肉瘤細胞PCNA陽性表達率明顯降低（P0.05）；HE染色后光鏡觀察，輻照區(qū)細胞結構被破壞，壞死區(qū)與周圍組織分界清楚；電鏡觀察顯示腫瘤細胞結構不清晰，細胞膜和核膜失去連續(xù)性，染色質固縮、碎裂呈團塊狀。HIFU+N2O-LM組與空白對照組、單純N2O組、單純HIFU組、HIFU+C3F8-LM組比較，腫瘤體積明顯減小，差異具統(tǒng)計學意義P＜0.05)；腫瘤組織PCNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結論N2O-LM能有效增強HIFU消融SD大鼠骨肉瘤的生物學效應，是一種良好的HIFU增效劑；對大鼠骨肉瘤細胞UMR-106移植瘤增殖有顯著的抑制效應， N2O-LM聯合HIFU有望為臨床治療骨肉瘤開辟一條新路。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R445.1;R738.1

【參考文獻】

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本文編號：2355429