本文關(guān)鍵詞：HRE調(diào)控VEGF表達轉(zhuǎn)染NSCs的實驗研究

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【摘要】：目的：獲得表達血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因工程神經(jīng)干細胞(Neural stem cells, NSCs),研究缺氧反應元件(hypoxia-reponsive element, HRE)在缺氧條件下是否能提高VEGF基因的表達,以期為缺氧缺血性腦損傷尋求一種安全、高效的基因治療方法。 方法：分離胎齡14天的SD大鼠胚胎前腦皮質(zhì),采用無血清培養(yǎng)的方法獲得細胞克隆,應用間接免疫熒光法鑒定NSCs和分化的神經(jīng)細胞。構(gòu)建攜帶VEGF165基因的兩種重組慢病毒載體pGC-FU-VEGF165,及9HRE-pGC-FU-VEGF165,將兩者分別轉(zhuǎn)染NSCs細胞,轉(zhuǎn)染后的NSCs分為7組：A組為轉(zhuǎn)染pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞、B1組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞,B2組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)6h的神經(jīng)干細胞,B3組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)12h的神經(jīng)干細胞,B4組為轉(zhuǎn)染9HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒后于缺氧條件下培養(yǎng)24h的神經(jīng)干細胞,C組為轉(zhuǎn)染空載體慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞,D組為未轉(zhuǎn)染慢病毒于常氧條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞作為的空白對照組,(常氧條件為95%02+5%C02；缺氧條件為2%02+98%N2)；熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測感染效率,采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因NSCs的VEGF基因表達水平,Western-blot及Elisa檢測轉(zhuǎn)染后細胞分泌型血管內(nèi)皮生長蛋白的表達水平,MTT法檢測轉(zhuǎn)染后NSCs的增殖活性。 結(jié)果： ①離體培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細胞呈Nestin陽性； ②經(jīng)測序兩組目的基因與GenBbank中序列完全一致,成功構(gòu)建HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒、pGC-FU-VEGF165慢病毒載體； ③將慢病毒轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干細胞分組后在熒光顯微鏡下觀察可見A組、B2組、B3組、B4組、C組基因工程神經(jīng)干細胞發(fā)出綠色熒光,B1組、D組未見綠色熒光；經(jīng)流式細胞儀檢測A組細胞轉(zhuǎn)染率50%左右,B2組、B3組、B4組、C組細胞轉(zhuǎn)染率為80%左右,B1組、D組細胞轉(zhuǎn)染率為0.49%左右； ④RT-PCR檢測C組、D組、B1組細胞無明顯VEGFmRNA表達,B2組、B3組、B4組、A組細胞均表達VEGFmRNA,B2組、B3組、B4組細胞、/EGFmRNA表達量顯著高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細胞隨著缺氧時間延長VEGFmRNA表達量增高(P0.05)； ⑤Western-blot檢測C組、D組、B1組無明顯VEGF蛋白表達,B2組、B3組、B4組、A組細胞均表達VEGF蛋白,B2組、B3組、B4組細胞VEGF蛋白表達量高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細胞隨著缺氧時間延長VEGF蛋白表達量增高(P0.05)； ⑥Elisa檢測C組、D組、B1組無明顯分泌型VEGF蛋白表達,B2組、B3組、B4組、A組細胞可表達分泌型VEGF蛋白,B2組、B3組、B4組細胞分泌型VEGF蛋白表達量高于A組(P0.05),且B組內(nèi)細胞隨著缺氧時間延長分泌型、/EGF蛋白表達量增高(P0.05)； ⑦MTT檢測示C組、D組細胞增殖活性無差異(P0.05),A組、B2組細胞增殖活性均高于與C組、D組(P0.05),B2組細胞增殖活性高于A組(P0.05)。 結(jié)論：成功構(gòu)建具有缺氧誘導特性的高表達VEGF的基因工程NSCs,證明NSCs-VEGF基因工程干細胞可分泌活性VEGF蛋白,促進神經(jīng)干細胞增殖,在缺氧時受HRE啟動子作用,能提高VEGF基因的表達,隨缺氧時間的改變HRE可對VEGF表達水平進行調(diào)控,為缺血缺氧性腦損傷實現(xiàn)安全、高效的基因治療方法提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細胞 血管內(nèi)皮細胞生長因子 缺氧反應元件 轉(zhuǎn)染
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文~.略詞簡表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定14-21
• 1.1 材料14-16
• 1.1.1 實驗動物14
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備14
• 1.1.3 主要試劑14-15
• 1.1.4 主要試劑的配制15
• 1.1.5 實驗器材的預處理15-16
• 1.2 方法16-18
• 1.2.1 胎鼠NSCs的原代培養(yǎng)16
• 1.2.2 NSCs的傳代培養(yǎng)16-17
• 1.2.3 NSCs體外誘導分化17
• 1.2.4 間接免疫熒光法鑒定NSCs17-18
• 1.3 結(jié)果18-19
• 1.3.1 原代NSCs生長情況18
• 1.3.2 NSCs體外誘導分化18-19
• 1.3.3 間接免疫熒光法鑒定NSCs19
• 1.4 討論19-20
• 1.4.1 神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)的條件及生長情況19
• 1.4.2 神經(jīng)細胞的鑒定19-20
• 1.5 小結(jié)20-21
• 第二部分 HRE調(diào)控VEGF表達轉(zhuǎn)染NSCs的實驗研究21-36
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 細胞22
• 2.1.2 主要儀器22
• 2.1.3 主要試劑及耗材22
• 2.1.4 主要試劑的配制22-25
• 2.2 方法25-31
• 2.2.1 pGC-FU-VEGF165重組慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF165重組慢病毒構(gòu)建25
• 2.2.2 慢病毒感染目的細胞25-26
• 2.2.3 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率26-27
• 2.2.4 PCR檢測VEGFmRNA含量27-29
• 2.2.5 Western-Blot檢測轉(zhuǎn)基因大鼠神經(jīng)干細胞體外VEGF165蛋白表達29-30
• 2.2.6 ELISA檢測基因工程神經(jīng)干細胞分泌型VEGF蛋白表達30
• 2.2.7 MTT檢測基因工程神經(jīng)干細胞增殖30-31
• 2.3 統(tǒng)計學方法31
• 2.4 結(jié)果31-33
• 2.4.1 pGC-FU-VEGF 165重組慢病毒、HRE-pGC-FU-VEGF 165重組慢病毒質(zhì)粒鑒定31
• 2.4.2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細胞31
• 2.4.3 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率31
• 2.4.4 RT-PCR檢測各組目的基因VEGF165在NSCs細胞中的表達31-32
• 2.4.5 Western blot檢測VEGF165蛋白在NSCs細胞中的表達水平32
• 2.4.6 ELISA檢測各組轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞分泌型VEGF蛋白表達32
• 2.4.7 MTT法檢測基因修飾的NSCs增殖活性32-33
• 2.5 討論33-34
• 2.5.1 目的基因的選擇33
• 2.5.2 HRE啟動子的選擇及其對目的基因VEGF的調(diào)控作用33-34
• 2.6 小結(jié)34-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 附圖41-51
• 綜述51-59
• 參考文獻56-59
• 致謝59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 徐磊;張凱倫;謝艾妮;夏家紅;;低氧反應元件對大鼠骨骼肌成肌細胞轉(zhuǎn)染表達血管內(nèi)皮生長因子基因的調(diào)控作用[J];臨床心血管病雜志;2007年06期

2 屈素清;欒佐;劉衛(wèi)鵬;席小輝;汪兆艷;;人神經(jīng)干細胞移植治療腦性癱瘓并重度視覺障礙患兒的療效[J];實用兒科臨床雜志;2009年10期

3 王東;張建軍;馬景擰;;神經(jīng)干細胞NgR基因沉默立體定向移植治療大鼠腦損傷[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年14期

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本文編號：727256