發(fā)布時間：2017-08-01 15:13

  本文關(guān)鍵詞：microRNA-106b致C2C12肌管胰島素抵抗的線粒體機制研究

  更多相關(guān)文章： miR-106b C2C12肌管 胰島素抵抗 線粒體功能障礙 2型糖尿病

【摘要】：肥胖和肥胖相關(guān)的2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共健康問題。目前認為,胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是T2DM重要的發(fā)病機制和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在胰島素的刺激下骨骼肌是攝取葡萄糖的主要器官,占葡萄糖利用率的75%；高胰島素血癥狀態(tài)下骨骼肌糖原合成障礙是胰島素抵抗和T2DM的重要特征。因此骨骼肌胰島素抵抗在全身系統(tǒng)性胰島素抵抗中具有重要地位。但是骨骼肌胰島素抵抗的具體機制尚未闡明。microRNA (miRNA)可在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達和翻譯,miRNA表達異常是胰島素抵抗和T2DM的重要發(fā)病機制。 miRNA是一類長度約為22-25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)、5'UTR和編碼區(qū)(coding sequence, CDS)互補配對,通過抑制蛋白質(zhì)翻譯,或促進mRNA降解途徑,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。近年來研究表明miRNA對胰島素的多種靶器官(如大腦、骨骼肌、脂肪組織、肝臟)葡萄糖的攝取均有調(diào)控作用。Saxena和Scott關(guān)于T2DM易感基因的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)與T2DM相關(guān)的基因變異位于基因的非編碼區(qū)。這正是miRNA主要作用區(qū)域,也支持miRNA表達異常和miRNA靶基因的異常調(diào)控是胰島素抵抗和T2DM的重要發(fā)病機制的推論。 本課題組發(fā)現(xiàn)miR-106b在db/db糖尿病小鼠骨骼肌中表達顯著升高。miR-106b屬于miR-106b-25cluster成員,定位于Mcm7基因第13個內(nèi)含子上。文獻報道,miR-106b在糖尿病患者骨骼肌中顯著高表達,后來又發(fā)現(xiàn)其在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖胰島素抵抗小鼠骨骼肌的表達量是正常飲食組的4.19倍,這與我們的結(jié)果高度一致,提示miR-106b異常高表達與骨骼肌胰島素敏感性有很大的相關(guān)性。已知線粒體功能障礙是肥胖相關(guān)的胰島素抵抗重要的發(fā)病機制。但是miR-106b在骨骼肌線粒體功能障礙和胰島素抵抗中的具體作用和機制尚未闡明。 為進一步深度挖掘miR-106b與骨骼肌胰島素敏感性的關(guān)系,我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-106b與線粒體融合蛋白-2(mitofusin-2, Mfn2)3'U]TR有高度保守的配對結(jié)合序列。Mfn2錨定于線粒體外膜,除介導(dǎo)線粒體融合和相關(guān)功能發(fā)揮外,其還位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜成為聯(lián)系線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的橋梁。早期人們發(fā)現(xiàn)Mfn2基因的啟動子區(qū)域含有過氧化物酶體增生物激活受體-γ共激活因子-α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α)和雌激素相關(guān)受體-α(estrogen-related receptor-a, ERR-a)的順式作用元件,后兩者共同激活Mfn2的轉(zhuǎn)錄。而且Mfn2和PGC-1α在維持線粒體膜電位和促進氧化磷酸化方面具有協(xié)同作用。文獻復(fù)習高度提示我們,Mfn2是調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體功能和胰島素敏感性的重要蛋白,存在一條包含PGC-1α/Mfn2信號通路參與調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素敏感性。 本課題第一部分,觀察miR-106b在C2C12成肌細胞誘導(dǎo)分化中的表達及其對誘導(dǎo)分化的影響,檢測白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-αa, TNF-αa)和棕櫚酸(palmitic acid, PA)干預(yù)下miR-106b表達變化；第二部分,探討miR-106b過表達和TNF-a干預(yù)下功能沉默對C2C12肌管胰島素敏感性、線粒體形態(tài)和功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,驗證靶基因Mfn2,探討miR-106b影響骨骼肌胰島素敏感性的線粒體機制。 第一部分：C2C12成肌細胞中miR-106b生物學(xué)功能研究 目的：①探討miR-106b在C2C12成肌細胞分化過程中的表達；②驗證miR-106b過表達和功能沉默細胞系建立成功；③觀察miR-106b表達對C2C12成肌細胞分化的影響；④檢測TNF-α、IL-6、PA干預(yù)下C2C12肌管miR-106b表達變化。 方法：①real-time PCR檢測C2C12成肌細胞分化過程中和不同濃度的TNF-α、IL-6、PA干預(yù)24小時、48小時C2C12肌管miR-106b表達變化；②miR-106b過表達慢病毒和miR-106b inhibitor sponge慢病毒分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞,獲得miR-106b過表達和功能沉默細胞系,real-time PCR驗證穩(wěn)定表達株建立成功；③經(jīng)2%馬血清誘導(dǎo)分化,real-time PCR檢測各組細胞分化過程中肌形成調(diào)節(jié)因子MyoD和nyogene mlRNA的表達,瑞吉姆薩染色觀察肌管的形態(tài)。 結(jié)果：①C2C12誘導(dǎo)分化前、后miR-106b表達量沒有明顯的差異；②miR-106b過表達和功能沉默穩(wěn)定細胞系建立成功；③MyoD mRNA在誘導(dǎo)分化過程中表達逐漸升高,在分化第6天表達量最高,myogene mRNA在分化第3天表達量最高,分化第6天表達下降。miR-106b過表達、沉默和對照組MyoD和myogene mRNA表達量沒有顯著差異。瑞吉姆薩染色顯示C2C12成肌細胞呈紡錘形或星形,單核,細胞核大而圓；分化成熟后細胞融合,體積明顯變大,長條形,多核,細胞核呈串珠樣改變。miR-106b過表達、功能沉默沒有明顯改變C2C12肌管的形態(tài)。④TNF-a上調(diào)C2C12肌管miR-106b的表達,具有時間和濃度依賴性,20ug/ml作用48h最顯著；PA上調(diào)C2C12肌管miR-106b的表達,具有濃度依賴性,200uM作用最顯著,同濃度刺激24小時和48小時沒有顯著差異：IL-6刺激前后miR-106b的表達沒有顯著差異。 結(jié)論：①miR-106b在C2C12成肌細胞分化前后表達沒有顯著差異,其對細胞分化也沒有明顯的影響；TNF-α、PA干預(yù)顯著提高C2C12肌管miR-106b的表達。 第二部分：miR-106b過表達、功能沉默對C2C12肌管胰島素敏感性的影響及線粒體機制分析 目的：(1)檢測miR-106b過表達對C2C12肌管胰島素敏感性、線粒體形態(tài)、功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,探討其影響胰島素敏感性的線粒體機制；(2)驗證miR-106b與Mfn23'UTR配對結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Mfn2蛋白的表達；(3)探討TNF-α干預(yù)下miR-106b功能沉默對C2C12肌管胰島素敏感性、線粒體形態(tài)、功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,探討miR-106b參與TNF-a誘導(dǎo)胰島素抵抗的機制。 方法：(1)慢病毒介導(dǎo)miR-106b過表達：C2C12誘導(dǎo)分化后,2-Deoxy-[3H]葡萄糖攝取實驗檢測C2C12肌管葡萄糖攝取率,Western Blot檢測細胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(glucose transporter-4,GLUT4)表達和胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)磷酸化水平,透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),流式細胞儀檢測C2C12肌管內(nèi)ROS含量、線粒體膜電位,real-time PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù),real-time PCR、Western B1ot檢測ERR-a/PGC-la mRNA和蛋白的表達；(2)熒光素酶報告基因檢測結(jié)合real-time PCR和Western Blot驗證miR-106b對靶基因Mfn2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用；(3)慢病毒介導(dǎo)miR-106b功能沉默：C2C12成肌細胞分化第5天,TNF-a刺激48小時后用于后續(xù)實驗。2-Deoxy-[3H]葡萄糖攝取實驗檢測miR-106b功能沉默后C2C12肌管葡萄糖攝取率,WesternBlot檢測細胞膜GLUT4表達,透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),]real-time PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù),real-time PCR、Western Blot檢測ERR-α/PGC-lα mRNA和蛋白的表達。 結(jié)果：(1)miR-106b過表達：①miR-106b過表達顯著降低C2C12肌管胰島素刺激的葡萄糖攝取,GLUT4細胞膜轉(zhuǎn)位,提高IRS-1-ser1101磷酸化水平；②miR-106b過表達后C2C12肌管出現(xiàn)自噬體堆積,圓球狀線粒體明顯增多。線粒體結(jié)構(gòu)破壞,線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)消失,線粒體嵴模糊,甚至出現(xiàn)空泡變性。③miR-106b過表達后顯著降低線粒體拷貝數(shù)、膜電位,顯著增加ROS含量,降低ATP含量未達到統(tǒng)計學(xué)意義。④miR-106b過表達顯著提高ERR-α/PGC-lαmRNA和蛋白的表達。 (2)靶標驗證：①miR-106b mimics顯著抑制雙熒光素酶活性(抑制率37%),結(jié)合位點1、2突變明顯提高雙熒光素酶活性,其中結(jié)合位點2突變效果更明顯,結(jié)合位點1+2突變顯著提高雙熒光素酶活性(提高20%)。②miR-106b過表達組與對照組相比,Mfn2mRNA表達沒有顯著差異,miR-106b過表達顯著降低Mfn2蛋白水平；miR-106b沉默顯著提高Mfn2mRNA和蛋白的表達。 (3)miR-106b功能沉默：①TNF-a20ng/ml刺激24小時顯著降低對照組胰島素刺激的葡萄糖攝取,而對miR-106b沉默組沒有顯著影響；正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高細胞膜GLUT4的表達量,TNF-α10ug/ml、20ng/ml處理后降低對照組GLUT4細胞膜轉(zhuǎn)位,對miR-106b功能沉默組沒有顯著影響。②正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高Mfn2mRNA的表達,TNF-α10ng/ml、20ng/ml干預(yù)后顯著降低對照組Mfn2mRNA表達,對miR-106b功能沉默組沒有明顯影響。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高Mfn2蛋白的表達,TNF-α20ng/ml顯著降低Mfn2蛋白的表達,miR-106b功能沉默顯著改善TNF-a誘導(dǎo)的Mfn2蛋白表達下調(diào)(TNF-α10ng/ml濃度下作用最顯著)。③TNF-a導(dǎo)致線粒體固縮、線粒體雙層膜消失、線粒體嵴模糊,甚至空泡變性,miR-106b功能沉默顯著改善線粒體形態(tài)破壞。④TNF-a顯著降低C2C12肌管ATP產(chǎn)量,miR-106b功能沉默顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的ATP產(chǎn)量降低。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高C2C12肌管線粒體拷貝數(shù),TNF-a干預(yù)對線粒體拷貝數(shù)沒有顯著影響。⑤C2C12肌管對照組TNF-α20ng/ml處理后PGC-1α蛋白表達量沒有顯著變化,PGC-1αmRNA表達顯著降低,miR-106b功能沉默顯著增加TNF-a刺激下PGC-1α mRNA和蛋白表達。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高ERR-αmRNA和蛋白的表達,TNF-α干預(yù)顯著降低對照組ERR-a蛋白表達,提向ERR-αmlRNA的表達,TNF-α對miR-106b功能沉默組ERR-αmRNA和蛋白的表達沒有顯著影響。 結(jié)論：miR-106b過表達可能主要通過下調(diào)靶基因Mfn2介導(dǎo)線粒體功能障礙,從而誘導(dǎo)C2C12肌管胰島素抵抗。miR-106b功能沉默可能通過上調(diào)靶基因Mfn2參與調(diào)控TNF-a誘導(dǎo)的線粒體功能功能障礙和胰島素抵抗。
【關(guān)鍵詞】：miR-106b C2C12肌管 胰島素抵抗 線粒體功能障礙 2型糖尿病
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R723.14;R725.8
【目錄】：

• 縮略詞一覽表6-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-19
• 前言19-23
• 第一部分 C2C12成肌細胞中microRNA-106b生物學(xué)功能研究23-34
• 引言23-24
• 材料與方法24-29
• 結(jié)果29-33
• 討論33-34
• 第二部分 microRNA-106b過表達、功能沉默對C2C12肌管胰島素敏感性的影響及線粒體機制分析34-58
• 引言34-35
• 材料與方法35-44
• 結(jié)果44-54
• 討論54-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻59-64
• 綜述64-82
• 參考文獻75-82
• 附錄82-87
• 致謝87-88

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張瑩;高春林;夏正坤;高遠賦;樊忠民;蔡曉懿;劉夢原;;MiR-106b在2型糖尿病db/db小鼠骨骼肌中的表達及生物信息學(xué)分析[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2013年03期

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本文編號：604849