第一部分RSV感染氣道上皮細(xì)胞株TLR1-10 mRNA表達(dá) 目的:為了解TLR家族在RSV誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用,體外培養(yǎng)9HTEo人類氣道上皮細(xì)胞株,觀察RSV感染后,9HTEo細(xì)胞TLR 1-10 mRNA的表達(dá)變化。 方法:RSV以MOI為10感染9HTEo細(xì)胞3小時(shí)后用半定量RT-PCR檢測(cè)TLR1-10 mRNA表達(dá);感染3、6和9小時(shí)后用Q-PCR檢測(cè)TLR1-10 mRNA的動(dòng)態(tài)變化,并以UV-RSV作為對(duì)照。 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果提示RSV感染上皮細(xì)胞后TLR2~10 mRNA表達(dá)均上調(diào),以TLR2和TLR6變化最為顯著;Q-PCR結(jié)果顯示:(1)9HTEo細(xì)胞株可表達(dá)TLR1-10 mRNA,其中以TLR4和TLR8 mRNA表達(dá)最高;(2) RSV感染上皮細(xì)胞6小時(shí)和\或9小時(shí)后,TLR1-10 mRNA均表達(dá)增高,而UV-RSV組TLR1-10mRNA無(wú)明顯變化。 結(jié)論:RSV感染氣道上皮細(xì)胞株后,TLR1-10 mRNA均被上調(diào),而無(wú)復(fù)制能力的RSV不能引起TLR1-10mRNA表達(dá)的變化,提示RSV誘導(dǎo)TLRs mRNA表達(dá)與病毒入胞復(fù)制有關(guān)。 第二部分RSV感染后氣道上皮細(xì)胞株TLR4蛋白表達(dá)及其功能研究 目的:觀察RSV感染后,氣道上皮細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能,與RSV在細(xì)胞復(fù)制的關(guān)系,進(jìn)一步探討RSV誘導(dǎo)氣道炎癥的可能機(jī)制。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-,RSV以MOI為10感染上皮細(xì)胞24小時(shí)后(1)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR4表達(dá)及與凋亡的關(guān)系;(2)用ELISA檢測(cè)RSV感染上皮細(xì)胞經(jīng)LPS刺激,并加入TLR4阻斷劑HTA125后,上清液中IL-8,IL-6和RANTES的含量;(3)運(yùn)用TLR4特異性的siRNA干擾9HTEo細(xì)胞TLR4表達(dá)后,接種RSV并予以LPS刺激,用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-8,IL-6的水平。用TLR4特異性siRNA干擾9HTEo細(xì)胞24小時(shí)后,①RSV以MOI為0.1感染細(xì)胞,連續(xù)3天收集上清液用Adeasy TCID50法檢測(cè)RSV感染性滴度的變化;②RSV以MOI為10感染細(xì)胞48小時(shí),ELISA方法檢測(cè)上清液中IL-8,IL-6,TNF-α和MCP-1的變化;③RSV以MOI為10感染細(xì)胞24小時(shí)后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:RSV感染9HTEo上皮細(xì)胞,膜上TLR4表達(dá)增高而胞內(nèi)TLR4表達(dá)降低,TLR4陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯增加,其中絕大部分為膜Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞;LPS誘導(dǎo)的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻斷,RANTES無(wú)明顯變化;在TLR4表達(dá)被干擾的情況下,LPS刺激僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分IL-8,不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。TLR4-siRNA組的RSV滴度變化與正常9HTEo細(xì)胞組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;RSV誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA 200nM組明顯低于對(duì)照組,而IL-8和TNF-α的水平無(wú)明顯變化;TLR4-siRNA組RSV誘導(dǎo)AnnexinV陽(yáng)性同時(shí)PI陰性的細(xì)胞群體百分比在TLR4-siRNA組明顯高于對(duì)照細(xì)胞組。 結(jié)論:RSV感染9HTEo細(xì)胞后,LPS再刺激產(chǎn)生IL-6是依賴于TLR4信號(hào)通路。氣道上皮細(xì)胞TLR4通路與RSV復(fù)制、RSV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌IL-8無(wú)關(guān),但與病毒誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌IL-6和MCP-1,以及病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。 第三部分RSV感染后氣道上皮細(xì)胞株TLR3蛋白的表達(dá)及其功能研究 目的:觀察RSV感染9HTEo上皮細(xì)胞后, TLR3蛋白表達(dá)變化及其信號(hào)通路的功能。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-,RSV(1)以MOI為1感染上皮細(xì)胞24小時(shí)后,提取細(xì)胞總蛋白,用Westernblot的方法檢測(cè)TLR3表達(dá)的變化,以TLR3激動(dòng)劑PolyIC刺激為對(duì)照;(2)以MOI為10接種上皮細(xì)胞4小時(shí)后,直接加入PolyIC到培養(yǎng)上清或用脂質(zhì)體將PolyIC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)刺激48小時(shí)后,用ELISA檢測(cè)上清液中IL-8,IL-6, IFN-α和IFN-β的表達(dá)。 結(jié)果:RSV感染后9HTEo上皮細(xì)胞后,TLR3蛋白表達(dá)量明顯增高,再經(jīng)胞內(nèi)TLR3激動(dòng)劑PolyIC刺激后,培養(yǎng)上清IL-8,IL-6和IFN-β含量明顯增加。 結(jié)論:RSV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞TLR3蛋白表達(dá)增高,TLR3通路可介導(dǎo)IL-8和IL-6和少量IFN-β產(chǎn)生,提示TLR3通路可能主要誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)而不是抗病毒反應(yīng)。 第四部分白藜蘆醇抑制RSV感染氣道上皮細(xì)胞株炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及其機(jī)制研究 目的:以地塞米松和利巴韋林為對(duì)照,觀察白藜蘆醇對(duì)RSV復(fù)制和對(duì)RSV誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用及其機(jī)制研究。 方法:(1)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞和Hep-2細(xì)胞株,RSV以MOI為0.1接種Hep-2細(xì)胞和9HTEo細(xì)胞4小時(shí)后,加入適宜濃度的白藜蘆醇,地塞米松和利巴韋林,連續(xù)5天收集各組上清液,用AdeasyTCID50方法檢測(cè)計(jì)算RSV滴度的變化;(2)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞,RSV以MOI為10接種9HTEo細(xì)胞4小時(shí),將PolyIC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)后再加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴韋林至48小時(shí)后,用ELISA檢測(cè)上清液中IL-8,IL-6的表達(dá)。(3)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細(xì)胞株9HTEo-細(xì)胞,RSV以MOI為1接種9HTEo細(xì)胞4小時(shí),加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴韋林,48小時(shí)后收集細(xì)胞提取蛋白用Westernblot檢測(cè)TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果:Hep-2細(xì)胞-白藜蘆醇100μM處理組和9HTEo細(xì)胞-白藜蘆醇處理組的RSV滴度明顯低于單純RSV組,相應(yīng)細(xì)胞的地塞米松處理組的RSV滴度無(wú)明顯變化,而利巴韋林組的RSV滴度明顯低于單純RSV組。RSV感染9HTEo細(xì)胞后,白藜蘆醇組和地塞米松組的IL-6水平明顯降低,但I(xiàn)L-8無(wú)明顯變化,利巴韋林組的IL-8和IL-6水平明顯降低;RSV感染9HTEo細(xì)胞后再給與胞內(nèi)PolyIC刺激后,白藜蘆醇組,地塞米松組的IL-8和IL-6水平均明顯降低,而利巴韋林組IL-8和IL-6無(wú)明顯變化。RSV感染9HTEo細(xì)胞后,白藜蘆醇處理組的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達(dá)明顯降低,TLR3蛋白無(wú)明顯變化;地塞米松組和利巴韋林組的TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表達(dá)均明顯降低。 結(jié)論:白藜蘆醇可抑制RSV在氣道上皮細(xì)胞中的復(fù)制和抑制dsRNA-TLR3通路的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達(dá),從而抑制RSV誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌的IL-6,提示白藜蘆醇抑制RSV感染后氣道炎癥反應(yīng)的作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

RSV 核酸 RT-PCR 產(chǎn)物本 2：陽(yáng)性對(duì)照 3：陰phresis of RSV nucleotiPositive Control 3：繁殖的 RSV 滴度，根稀釋度病毒感染后細(xì)ication manual （ver選擇偏小值計(jì)算 TCD50/ml。

圖 1-2 TCID50 法檢測(cè) RSV 滴度（A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID50/mFig 1-2 RSV titration by TCID50 assay (A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID502.1.2 RSV 病毒感染 9HTEo 上皮細(xì)胞株氣道上皮細(xì)胞是 RSV 復(fù)制的靶細(xì)胞，而我們選用的細(xì)胞株來(lái)源于人類皮細(xì)胞，因此首先我們需要確定 RSV 能否感染 9HTEo 細(xì)胞。RSV 以 MO感染 9HTEo 細(xì)胞感染 24 小時(shí)后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)明顯的細(xì)胞融合病變熒光免疫法也可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光，說(shuō)明 RSV 病毒能夠感染 9H胞株，而 UV-RSV 接種的細(xì)胞無(wú)明顯病變。

RSV染 9HTEo 細(xì)胞后的細(xì)胞病變和直接熒光免疫檢測(cè)結(jié)pathological effect of RSV-infected 9HTEo cells anddetection by direct fluorescent assay (×100 )TEo 上皮細(xì)胞株 3 小時(shí)后 TLR1-10 m示 9HTEo 細(xì)胞株可表達(dá) TLR1~10，TLR1 表K）TLR mRNA 表達(dá)，凝膠成像可見(jiàn) RSV 組R4 的其余 TLR 條帶亮度增強(qiáng)，mRNA 表達(dá)呈最為明顯。1 23456 789101112
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