【摘要】： 在過(guò)去的三十年中,哮喘等變應(yīng)性疾病在世界范圍內(nèi)明顯增加。據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心研究顯示,美國(guó)哮喘發(fā)病率從1980年到1994年增加了75%,以0～4歲兒童增加最明顯,高達(dá)160%。我國(guó)兒童哮喘發(fā)病情況亦不容樂(lè)觀(guān),0～14歲兒童哮喘患病率1990年到2000年10年間從0.78 %上升到2.06 % ,增加了1.6倍。盡管遺傳因素與哮喘發(fā)生明確相關(guān),由于人類(lèi)遺傳背景短期內(nèi)不可能發(fā)生明顯變化,因此哮喘明顯增加可能是環(huán)境因素改變的結(jié)果,這也正是“衛(wèi)生假說(shuō)”的觀(guān)點(diǎn)。衛(wèi)生假說(shuō)認(rèn)為在西方國(guó)家由于公共衛(wèi)生設(shè)施改善、疫苗及抗生素使用以及腸道菌群改變,使感染發(fā)生率降低,微生物對(duì)嬰幼兒正在發(fā)育的免疫系統(tǒng)刺激作用減弱,造成哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生率大幅度升高。人類(lèi)流行病學(xué)研究顯示,抗生素使用和腸道菌群改變與哮喘發(fā)病率升高相關(guān)。為了探討抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)和哮喘的關(guān)系,我們建立了抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠模型,在該模型上采用煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā),以探討抗生素所致腸道菌群失調(diào)與氣道變應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)系,并進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)性哮喘模型上了解腸道菌群失調(diào)對(duì)哮喘發(fā)作嚴(yán)重程度的影響以及在RSV感染動(dòng)物模型上了解對(duì)RSV感染后肺部T輔助細(xì)胞極化方向的影響,評(píng)價(jià)抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生中的作用,為哮喘的防治提供理論依據(jù)。 目的:采用抗生素頭孢哌酮誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào),通過(guò)觀(guān)察小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫以及TLR2、4基因表達(dá)變化,探討抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)后對(duì)機(jī)體適應(yīng)性免疫和天然免疫的影響。 方法:60只4周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組:抗生素組和對(duì)照組,抗生素組小鼠連續(xù)7d口服頭孢哌酮,第7d經(jīng)口給予白色念珠菌。對(duì)照組用等量生理鹽水代替頭孢哌酮、白色念珠菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第8d每組小鼠隨機(jī)取10只用于盲腸內(nèi)容物細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)、糞便含水量和體重變化的檢測(cè),以了解腸道菌群失調(diào)情況。其余小鼠用于免疫功能檢測(cè),包括脾指數(shù)、PHA誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞數(shù)和PCR測(cè)TLR2、4 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果:⑴抗生素組小鼠腸道內(nèi)腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌較對(duì)照組明顯減少,白色念珠菌增加,小鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)伴糞便含水量增加和體重減輕;⑵抗生素組小鼠脾指數(shù)(0.0035±0.0002)較對(duì)照組(0.0055±0.0008)降低;⑶抗生素組PHA誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(0.0086±0.0016)較對(duì)照組(0.0147±0.0020)減少;⑷抗生素組小鼠經(jīng)綿羊紅細(xì)胞攻擊后足跖增加的厚度(0.094±0.013mm)較對(duì)照組(0.152±0.021mm)少;⑸抗生素組小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)(0.193±0.004)較對(duì)照組(0.215±0.007)低;⑹脾臟的TLR2和TLR4基因表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)。 結(jié)論:抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后小鼠細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能以及TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)均降低,說(shuō)明天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答能力均降低,提示抗生素致腸道菌群失調(diào)對(duì)機(jī)體免疫功能有明顯影響。 第二部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)與變應(yīng)性氣道反應(yīng)的關(guān)系研究 目的:在抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠模型上采用煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā),誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性反應(yīng),探討抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)與氣道變應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)系。 方法:40只雌性BALB/c小鼠分為4組,每組10只。①抗生素組:口服頭孢哌酮7 d,第7d給予50μl白色念珠菌1次,9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽水;②激發(fā)組:1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原50μl;③抗生素加激發(fā)組:前7d處理同抗生素組,9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原50μl;④對(duì)照組:1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽水。所有小鼠于第19d檢測(cè)BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子INF-γ和IL-4水平、肺部病理和轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet mRNA表達(dá)。 結(jié)果:⑴激發(fā)組和抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增加,尤以抗生素加激發(fā)組小鼠更為明顯;⑵抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中IL-4(45.35±2.36pg/ml)水平較對(duì)照組(35.32±2.53 pg/ml)增加,IFN-γ水平無(wú)明顯變化;⑶4組小鼠肺組織病理學(xué)顯示均無(wú)明顯炎癥浸潤(rùn);⑷肺組織中轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達(dá)水平(0.57±0.023)比對(duì)照組(0.41±0.020)高,T-bet/GATA-3比值(0.58±0.021)較對(duì)照組(0.80±0.035)降低。 結(jié)論:抗生素致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)過(guò)煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā),可致Th2優(yōu)勢(shì)的氣道變應(yīng)性反應(yīng),提示抗生素致腸道菌群失調(diào)是誘發(fā)哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。 第三部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在實(shí)驗(yàn)性小鼠哮喘模型上的效應(yīng)觀(guān)察 目的:采用OVA致敏和激發(fā)建立實(shí)驗(yàn)性哮喘模型,在致敏階段用抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào),探討抗生素致腸道菌群失調(diào)對(duì)哮喘發(fā)作嚴(yán)重程度的影響。 方法:54只小鼠分為3組,每組18只。哮喘組采用OVA致敏和激發(fā);抗生素加哮喘組也采用OVA致敏和激發(fā),在OVA致敏過(guò)程中加用抗生素和白色念珠菌誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào);對(duì)照組采用對(duì)照佐劑致敏和PBS激發(fā),處理同哮喘組。激發(fā)結(jié)束后檢測(cè)BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平、肺組織病理評(píng)分以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺部DC亞型和成熟度。 結(jié)果:⑴經(jīng)過(guò)OVA致敏和激發(fā),小鼠出現(xiàn)喘息癥狀,BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均較對(duì)照組顯著升高,IFN-γ水平降低,IL-4水平升高,肺組織可見(jiàn)明顯炎癥,說(shuō)明OVA致敏和激發(fā)建立的實(shí)驗(yàn)性哮喘模型成功;⑵和哮喘組比較,抗生素加哮喘組小鼠喘息癥狀、BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)、IFN-γ和IL-4水平、肺部病理評(píng)分以及肺部DC亞型無(wú)顯著差異;肺部DC成熟度有顯著差異。 結(jié)論:抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在實(shí)驗(yàn)性哮喘模型上對(duì)肺部DC成熟度有明顯影響,但抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)對(duì)肺部免疫狀態(tài)的影響很小,不足以影響哮喘發(fā)作的嚴(yán)重程度。 第四部分抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)在RSV感染小鼠模型上對(duì)肺部免疫狀態(tài)的影響 目的:在RSV感染小鼠模型上采用抗生素致腸道菌群失調(diào)后,煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性反應(yīng),探討感染RSV后用抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)對(duì)RSV感染后肺部Th1/Th2極化方向的影響。 方法:54只BALB/c小鼠分為3組,每組18只。RSV組小鼠鼻腔接種RSV,感染后9d和16d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā);抗生素加RSV組小鼠鼻腔接種RSV后連續(xù)口服抗生素頭孢哌酮7d,感染后7d經(jīng)口給予白色念珠菌,感染后9d和16d進(jìn)行煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)。對(duì)照組小鼠鼻腔滴入等量病毒培養(yǎng)液,滴鼻后9d和16d進(jìn)行煙曲霉菌變應(yīng)原氣道激發(fā)。RSV感染后19d檢測(cè)BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平、肺組織病理評(píng)分以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺部DC亞型和成熟度。 結(jié)果:⑴小鼠感染RSV后,BALF接種到Hep-2細(xì)胞可以引起典型CPE,直接免疫熒光證實(shí)肺部有RSV抗原,BALF中細(xì)胞總數(shù)升高,以淋巴細(xì)胞增加為主,肺部可見(jiàn)明顯炎癥,說(shuō)明RSV感染小鼠模型建立成功;⑵與RSV組比較,抗生素加RSV組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)、IL-4、IL-10和IFN-γ水平、肺部病理評(píng)分以及肺部DC亞型和成熟度無(wú)顯著差別。 結(jié)論:抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)和氣道變應(yīng)原激發(fā)并不改變RSV感染后肺部Th1/Th2細(xì)胞的極化方向。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R725.6

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孫大慶;腸道菌群失調(diào)致肺部過(guò)敏反應(yīng)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2802992