【摘要】：第一部分腸道病毒71型感染人Jurkat細(xì)胞模型的建立目的建立腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)體外感染人Jurkat細(xì)胞模型。方法EV71毒株由廣西疾病預(yù)防控制中心于2008年從手足口病患者糞便中分離獲得并保存。EV71病毒以感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)=5的條件感染生長旺盛的Jurkat細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組,每天在倒置顯微鏡下觀察并記錄病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),并于感染24小時(shí)后收集細(xì)胞,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和懸浮細(xì)胞免疫熒光染色方法驗(yàn)證EV71能否感染人Jurkat細(xì)胞。結(jié)果1.RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,EV71感染人Jurkat細(xì)胞的擴(kuò)增條帶與陽性對(duì)照EV71感染橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Rhabdomyosarcoma cells,RD)的目的條帶位置相符;陰性對(duì)照未感染EV71人Jurkat細(xì)胞則未見條帶。RT-PCR結(jié)果證實(shí)EV71可感染人Jurkat細(xì)胞。2.懸浮細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,EV71抗原可與EV71特異性單克隆抗體結(jié)合,在熒光顯微鏡下可觀察到EV71感染的Jurkat細(xì)胞EV7l免疫反應(yīng)陽性,陽性細(xì)胞的胞體為綠色熒光,并覆蓋胞核;陰性對(duì)照未感染EV71 人Jurkat細(xì)胞則未見染色。免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)EV71可感染Jurkat細(xì)胞。3.倒置顯微鏡下觀察EV71感染人Jurkat細(xì)胞可引起CPE反應(yīng),細(xì)胞體積增大,呈氣球樣改變,胞核腫脹,胞漿呈顆粒樣變化,胞膜邊緣不整齊,細(xì)胞逐漸破碎死亡;正常對(duì)照組細(xì)胞則未見CPE反應(yīng)。結(jié)論成功建立EV71體外感染人Jurkat細(xì)胞模型,為進(jìn)一步的發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。第二部分腸道病毒71型感染人Jurkat細(xì)胞模型對(duì)γ-干擾素分泌的影響目的在分子水平和蛋白水平上探討EV71感染對(duì)人Jurkat細(xì)胞γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)分泌的影響。方法EV71病毒以MOI=5的條件感染Jurkat細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照37℃培養(yǎng),收集感染6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的感染組和正常對(duì)照組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,以目的基因IFN-γ和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)。根據(jù)目的基因IFN-γ和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值,采用相對(duì)定量2-ΔΔCt方法計(jì)算IFN-γ的m RNA相對(duì)表達(dá)量,Fold Change為感染組相對(duì)未感染組基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組IFN-γ的分泌水平之間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,72小時(shí)感染組IFN-γ的m RNA相對(duì)表達(dá)量為2.62±0.79,與48小時(shí)感染組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),高于24小時(shí)感染組(P0.05),明顯高于6小時(shí)感染組和正常對(duì)照組(P0.01);48小時(shí)感染組IFN-γ的m RNA相對(duì)表達(dá)量為2.37±0.87,與24小時(shí)感染組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),明顯高于6小時(shí)感染組和正常對(duì)照組(P0.01);24小時(shí)感染組(1.48±0.77)、6小時(shí)感染組(0.96±0.19)和正常對(duì)照組(1.00±0.00)IFN-γ的m RNA相對(duì)表達(dá)量之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.ELISA檢測結(jié)果顯示,在感染EV71的Jurkat細(xì)胞與未感染EV71的Jurkat細(xì)胞中IFN-γ均僅有極低量表達(dá),正常對(duì)照組、6小時(shí)感染組、24小時(shí)感染組、48小時(shí)感染組和72小時(shí)感染組IFN-γ的分泌水平之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.在分子水平上,EV71感染可引起人Jurkat細(xì)胞中IFN-γm RNA的表達(dá)水平升高,其升高水平與感染時(shí)間相關(guān)。2.在蛋白水平上,EV71感染人Jurkat細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ無明顯表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.1
【圖文】：

和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證 EV71 能否感染人 Jurk證 EV71 能否感染人 Jurkat 細(xì)胞，我們使用 EV71 Jurkat 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照（RD 細(xì)胞）和陰時(shí)后收集細(xì)胞，用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，以進(jìn)行 PCR 檢測。結(jié)果如圖 1-1 所示，第 1 泳道是的 RD 細(xì)胞，可見 934bp 的目的條帶；第 2 泳道胞，可見擴(kuò)增條帶與陽性對(duì)照目的條帶位置相符照的未感染 EV71 的 Jurkat 細(xì)胞。EV71 感染人 性對(duì)照 EV71 感染 RD 細(xì)胞的目的條帶位置相符Jurkat 細(xì)胞則未見條帶。RT-PCR 結(jié)果證實(shí) EV71

圖 1-2 懸浮細(xì)胞免疫熒光染色驗(yàn)證 EV71 能否感染圖-EV71：為 EV71 感染的 Jurkat 細(xì)胞；圖-DAPI-1：為 DAPI 圖-Merged：為圖-EV71 和圖-DAPI-1 的疊加；圖-Mock：為未圖-DAPI-2：為 DAPI 染色的未感染 EV71 Fig.1-2 EV71-infected Jurkat cells demonstrated using suspstaining(400×)[Detection of EV71 antigen in EV71-infected mmunofluorescence staining.Jurkat cells were incubated with EV7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 齊向云;李康;夏燕平;楊靜;戴岳;;腸道病毒71型在RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)特征[J];生物技術(shù)通訊;2014年03期

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本文編號(hào)：2734034