【摘要】：目的構(gòu)建野生型和突變型SMARCAL1慢病毒載體,初步研究Schimke免疫-骨發(fā)育不良(SIOD)新發(fā)致病突變對SMARCAL1蛋白表達的影響。方法采集一例新確診SIOD患兒外周血樣本進行基因測序,通過檢測發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變位點,利用蛋白質(zhì)分析軟件初步預(yù)測新發(fā)突變蛋白功能。利用PCR技術(shù)合成野生型和突變型SMARCAL1基因序列,突變型SMARCAL1基因序列包含新發(fā)突變位點。準(zhǔn)備載體pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO,通過酶切反應(yīng)獲得線性化載體。設(shè)計包含酶切位點的引物,利用PCR擴增技術(shù)獲得野生型和突變型SMARCAL1基因片段。利用HB-infusion~(TM)無縫克隆試劑盒將線性化載體和目的基因片段進行連接重組,重組質(zhì)粒產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞DH5α懸液進行轉(zhuǎn)化,挑取平板單個菌落進行PCR鑒定,選取陽性克隆轉(zhuǎn)化子測序分析。分別對序列正確的野生型重組轉(zhuǎn)化子和突變型重組轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒抽提,抽提的質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同感染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時和72小時兩次收集病毒上清,超速離心純化,測定病毒滴度后分裝保存。傳代培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,通過預(yù)實驗摸索慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞最適Polybrene濃度和最適MOI值。分別用空載型、野生型和突變型慢病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,用適宜濃度的嘌呤霉素連續(xù)篩選并傳3代,得到三組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。分別提取正常HEK293細(xì)胞及空載型、野生型、突變型穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的總蛋白,利用Western Blot技術(shù)檢測四組細(xì)胞中SMARCAL1蛋白的表達情況。結(jié)果SIOD患兒基因檢測發(fā)現(xiàn)SMARCAL1基因(NM_014140.3)Exon5:c.1071delT;p(Phe357fs)。該突變?yōu)橐拼a突變,蛋白質(zhì)分析軟件預(yù)測為有害,預(yù)計會導(dǎo)致SMARCAL1基因所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生截短從而影響其正常生物功能。HGMD數(shù)據(jù)庫未見該突變的相關(guān)報道,且ESP6500siv2_ALL、千人基因組和dbSNP147等數(shù)據(jù)庫均未見收錄。通過分別對野生型和突變型陽性克隆轉(zhuǎn)化子測序,并分析比對野生型和突變型SMARCAL1基因片段序列,證實與野生型、突變型目標(biāo)區(qū)序列一致,提示成功構(gòu)建野生型和突變型SMARCAL1過表達慢病毒載體。慢病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時后,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,提示轉(zhuǎn)染成功。Western Blot結(jié)果顯示:突變組SMARCAL1蛋白表達水平明顯低于野生組、正常組和空載組,P0.05;提示新發(fā)突變造成SMARCAL1蛋白表達減少。結(jié)論患兒外周血基因檢測發(fā)現(xiàn)SMARCAL1新發(fā)移碼突變,蛋白質(zhì)分析軟件預(yù)測該移碼突變會導(dǎo)致SMARCAL1基因所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生截短從而影響其正常生物功能。成功構(gòu)建了野生型和突變型SMARCAL1過表達慢病毒載體,用于后續(xù)體外細(xì)胞實驗研究。成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得野生型和突變型SMARCAL1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。Western Blot證實SMARCAL1新發(fā)突變?yōu)镾IOD致病突變。
【圖文】：

實驗方法（2）純化：將收集到 50 mL 離心管中的病毒上清，4℃，2000×g 離心 10細(xì)胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速離心管中，4℃，82700×g 離，將得到的慢病毒超離液分裝到滅菌處理的病毒管中。標(biāo)記病毒名稱及年-80℃冰箱保存。2.4.5 慢病毒滴度測定（1）細(xì)胞準(zhǔn)備：將生長狀態(tài)良好的 293T 細(xì)胞消化重懸，細(xì)胞計數(shù)后加稀釋至 1×105/ml,每孔 100μl 鋪入 96 孔板，即每孔約 1×104個細(xì)胞，每種，做好標(biāo)記。置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。（2）第一天：在 EP 管中做 10 倍梯度稀釋，連續(xù) 6 個稀釋度。稀釋方毒準(zhǔn)備 6 個 1.5mlEP 管，每管加 90μl 完全培養(yǎng)基，往管 1 中加入 10μl 勻后吸取 10μl 加入管 2 中混勻。以此類推如圖 2。然后把每種病毒稀毒液分別加入對應(yīng)的 6 個孔中與細(xì)胞 37℃孵育過夜。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果1 野生型和突變型 SMARCAL1 過表達載體測序結(jié)果經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化載體與目的基因擴增片段，，通過重組反應(yīng)進行體外環(huán)化。重組的目的基因質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選單克隆菌落進行 PCR 鑒定，得到陽性克隆轉(zhuǎn)化子。通過分別對野生型和突變型陽性克隆轉(zhuǎn)化子測序（結(jié)果見圖 3-4），并分析比對野生型和突變型 SMARCAL1 基因片段序列（結(jié)果見圖 5-6），證實與野生型、突變型目標(biāo)區(qū)序列一致。說明成功構(gòu)建野生型和突變型 SMARCAL1 重組質(zhì)粒載體，可用于下一步慢病毒包裝。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R726.8

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曾令兵;張林;孟彥;葉林柏;;HIV-1缺損慢病毒載體的高滴度制備及其介導(dǎo)的高效基因轉(zhuǎn)移[J];微生物學(xué)報;2007年06期

2 趙倩;夏鳳艷;劉聰慧;;生長激素抑制素基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J];華北理工大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年05期

3 盧曉芳;杜晶春;李磊;賴文玉;張秀明;李偉強;楊霞;項鵬;;新型慢病毒載體的構(gòu)建及其在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

4 張薇;趙志英;張坤;;慢病毒載體及應(yīng)用研究進展[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年05期

5 沈上杭;王占祥;陳玉英;毛賀輝;;HIF-1α基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];中國實用醫(yī)藥;2010年04期

6 劉吉宏;李峰;郝子悅;李碧春;陳學(xué)進;;慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因動物研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2008年02期

7 李麗;張日;岑建農(nóng);朱子玲;;VEGF基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年01期

8 楊玉芳;丁彥青;梁麗;翁德勝;;LMP1基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及表達性能鑒定[J];中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志;2006年03期

9 楊玉芳;慢病毒載體與基因治療[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2003年03期

10 何佳平;張敬之;;慢病毒載體轉(zhuǎn)錄“通讀”改進研究進展[J];生物工程學(xué)報;2011年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張麗萍;;慢病毒載體安全性改進研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會第一屆全國學(xué)術(shù)會議暨2016年浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)年會論文匯編[C];2016年

2 張麗萍;高越;蔡勤;張敬之;;僅有部分慢病毒載體在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了功能性整合[A];第十四次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2015年

3 馮東福;畢永延;陳二濤;王永志;楚勝華;;小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒載體的構(gòu)建及神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

4 王海彬;;雌激素相關(guān)受體α基因超表達慢病毒載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

5 宋力;何佳平;方_g聃;曾凡一;張敬之;;降低慢病毒載體轉(zhuǎn)錄通讀率以避免激活其被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞基因組DNA的表達進而提高其臨床應(yīng)用安全性的研究[A];2017中國長三角遺傳學(xué)大會會議手冊[C];2017年

6 李振宇;徐開林;潘秀英;陳香梅;鹿群先;主鴻鵠;李慧;陳海英;何徐彭;;慢病毒載體的構(gòu)建及其包裝細(xì)胞系的建立[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國血液學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

7 方_g聃;謝書陽;龔秀麗;任兆瑞;曾凡一;張敬之;;慢病毒載體對內(nèi)含子的保護現(xiàn)象的探究[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

8 張曉宇;秦宜德;王超;張文曉;王巍;何曉光;;牛乳鐵蛋白肽基因的慢病毒載體構(gòu)建[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2010年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2010年

9 李振宇;徐開林;潘秀英;鹿群先;;慢病毒載體的構(gòu)建、改造及其包裝細(xì)胞系的建立[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

10 李振宇;徐開林;潘秀英;鹿群先;孫海英;主鴻鵠;陳香梅;何徐彭;;慢病毒載體的構(gòu)建、改造及其包裝細(xì)胞系的建立[A];第九屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 馬思遠;新型靶向DC慢病毒載體通過自噬途徑誘導(dǎo)HBV特異性CTL反應(yīng)的實驗研究[D];上海交通大學(xué);2018年

2 楊玉芳;用LMP1構(gòu)建重組慢病毒載體及建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 張文卿;HCMV pp150表達及E1-pp65慢病毒載體刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究[D];山東大學(xué);2006年

4 吳福國;表達Cdc42-shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對膀胱癌細(xì)胞影響的實驗研究[D];蘭州大學(xué);2007年

5 徐世永;慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

6 曹磊;轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在人非小細(xì)胞肺癌中的表達及其對腫瘤生物學(xué)行為的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

7 鄧志鴻;人促血管生成素-2基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其抑制人膠質(zhì)瘤體內(nèi)外實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

8 項永生;強化表達VEGF的骨髓基質(zhì)細(xì)胞系的構(gòu)建及其鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

9 汪亦男;KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子機制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

10 康楷;VEGF-A-siRNA和CXCR4-siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及對卵巢癌的基因治療[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 唐瑩;Schimke免疫-骨發(fā)育不良新發(fā)致病突變的初步研究[D];青島大學(xué);2019年

2 邰苗苗;山羊gDB124沉默慢病毒載體的構(gòu)建和穩(wěn)轉(zhuǎn)系的建立[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 買買提沙吾提阿吉·麥麥提;慢病毒介導(dǎo)miR-146a在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達實驗研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2019年

4 冉江霞;小鼠TREM2基因過表達和shRNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

5 潘正蘭;IL-6過表達慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建及其對HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

6 吳玉銘;大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)及CEMP1基因轉(zhuǎn)染研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2018年

7 何劍;ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒載體構(gòu)建[D];南華大學(xué);2018年

8 彭敏;構(gòu)建CRISPR/Cas9慢病毒載體敲除大鼠肝星狀細(xì)胞COX-2基因[D];南華大學(xué);2018年

9 伊青;HJURP基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建及其對人肝癌細(xì)胞株HepG2生物學(xué)行為的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 高鑫;EGFR特異性嵌合抗原受體慢病毒載體構(gòu)建及熒光素酶標(biāo)記靶細(xì)胞制備[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2018年

本文編號：2598954