發(fā)布時(shí)間：2020-03-23 03:26

【摘要】：先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是胚胎發(fā)育時(shí)期由于心管扭曲成袢異常,或出生后應(yīng)自動(dòng)關(guān)閉的通道未能閉合而引起的心臟解剖結(jié)構(gòu)異常,是新生兒最常見的出生缺陷,也是全球范圍內(nèi)嬰幼兒死亡的主要原因之一。流行病學(xué)資料顯示,先天性心臟病的出生患病率約為0.6%~1.2%。先天性心臟病的主要類型有室間隔缺損(Ventricular septal defects,VSDs)、房間隔缺損(Atrial septal defects,ASDs)、房室間隔缺損(atrioventricular septal defect,AVSD)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(Patent ductus arteriosus,PDA)、法洛四聯(lián)癥(Tetralogy of Fallot,TOF)、右心室雙向流出道(Right ventricular outflow tract,RVOT)等。法洛四聯(lián)癥是最嚴(yán)重的紫紺型先天性心臟病之一,是由于胚胎時(shí)期圓錐動(dòng)脈干發(fā)育異常所致,在新生兒中出生患病率約為1/3000,占到所有先天性心臟病的5%。隨著先進(jìn)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,TOF的早期致死率并不高,但患者會(huì)伴有長期的后遺癥,如心率不齊、心室功能性障礙甚至導(dǎo)致終生的殘疾。先天性心臟病的病因復(fù)雜,一般認(rèn)為與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān)。環(huán)境因素主要是母親孕期暴露,包括有害環(huán)境暴露,藥物暴露,營養(yǎng)因素等。大量的遺傳學(xué)研究已證實(shí)先天性心臟病的發(fā)生與遺傳因素有關(guān),主要包括染色體異常、單基因遺傳缺陷、多基因缺陷、拷貝數(shù)變異等。法洛四聯(lián)癥作為最常見的紫紺型先天性心臟病,遺傳致病原因多種多樣,染色體異常包括染色體22q11.2缺失(DiGeorge綜合癥)和21三體(Down綜合癥)等,分別占法洛四聯(lián)癥發(fā)病率的15%和7%。TBX1,NKX2-5,GATA4,ZFPM2,GATA6,GDF1,JAG1等單個(gè)基因的變異都會(huì)引起法洛四聯(lián)癥。然而大部分法洛四聯(lián)癥患者的遺傳病因并不明確。以往研究多針對基因的編碼區(qū)域,而目前大量研究報(bào)道了遠(yuǎn)端調(diào)控元件中非編碼突變導(dǎo)致疾病發(fā)生,例如,Smemo S等~([1])通過基因組學(xué),生物信息學(xué)和小鼠基因工程結(jié)合,證明TBX5增強(qiáng)子中的非編碼突變可能引起與TBX5功能障礙相關(guān)的CHD。Sankaran VG等對在β-珠蛋白基因座上有異常缺失的3個(gè)家系進(jìn)行研究,鑒定出一個(gè)胎兒血紅蛋白(基因)沉默所必需的靠近δ-珠蛋白基因的基因間區(qū)域。但是非編碼變異在人類復(fù)雜疾病(包括先天性心臟病)中的潛在作用仍然知之甚少。隨著Roadmap表觀基因組學(xué)項(xiàng)目(Epigenomics Roadmap Project)和DNA元件百科全書計(jì)劃(Encyclopedia of DNA Elements,ENCODE)等大型非編碼區(qū)研究項(xiàng)目的開展,非編碼區(qū)域突變受到越來越多的關(guān)注。自人類基因組計(jì)劃完成以來,二代測序技術(shù)飛速發(fā)展,通過借助全基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)工具,可以最大程度地利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)研究法洛四聯(lián)癥新的致病基因和致病位點(diǎn),從而更深層次地揭示法洛四聯(lián)癥的分子機(jī)制。本課題對兩個(gè)單純型法洛四聯(lián)癥核心家系(兩個(gè)非患病父母和一個(gè)患病孩子)成員進(jìn)行了全基因組測序(whole genome sequencing,WGS),測序數(shù)據(jù)使用針對編碼區(qū)突變,調(diào)控元件中非編碼區(qū)突變以及復(fù)合雜合突變的致病變異篩選流程,嘗試探索單純型法洛四聯(lián)癥患者的遺傳學(xué)病因。通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫和軟件分析注釋編碼突變(包括新生和遺傳性突變),以及調(diào)控元件中的非編碼突變。發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)不存在滿足美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南標(biāo)準(zhǔn)的致病性突變(第一類突變)。我們將其余預(yù)測為潛在有害的編碼突變歸為一類用于后續(xù)研究(第二類突變),并且基于積分法預(yù)測調(diào)控元件(IM-PET)方法得到的調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫,在非編碼區(qū)鑒定了位于調(diào)控元件中的潛在有害突變,隨后把相同基因上的復(fù)合雜合突變歸為一類(第三類突變)。使用ToppGene軟件對復(fù)合雜合突變所在目標(biāo)基因進(jìn)行優(yōu)先排序,最終在先證者中鑒定了位于優(yōu)先基因上的可能致病編碼突變和非編碼突變組合的復(fù)合雜合模式。在先證者P1中,檢測到NOTCH1外顯子及其調(diào)控元件中的雙等位基因突變(chr9:g.139409115AT,p.Asn685Ile;chr9:g.13944949 CA)分別遺傳自先證者的父母。在先證者P2中發(fā)現(xiàn)與P1類似的遺傳模式,鑒定了可能調(diào)控FN1基因功能的復(fù)合雜合突變(chr2:216235029CT,p.Val2281Met;chr2:g.2166525154AC),分別位于FN1基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。NOTCH1是已發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典先天性心臟病病致病基因。我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),熒光素酶報(bào)告基因等體外功能實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證NOTCH1潛在調(diào)控元件及其調(diào)控區(qū)域內(nèi)相應(yīng)非編碼突變的功能效應(yīng)。CRISPR/Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在NOTCH1非編碼區(qū)域雜合敲除(Region~(+/-))和純合敲除(Region~(-/-))的HEK293T細(xì)胞克隆中,NOTCH1基因的表達(dá)顯著高于野生型克隆(Region~(+/+)),表明這個(gè)潛在調(diào)控區(qū)域發(fā)揮沉默子的功能。并且純合敲除克隆(Region~(-/-))中的NOTCH1表達(dá)最高,說明存在一定的劑量敏感效應(yīng)。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,攜帶非編碼突變序列的質(zhì)粒熒光素酶活性水平顯著低于野生型,表明調(diào)控元件上的非編碼突變增加了沉默子的活性,導(dǎo)致NOTCH1的表達(dá)進(jìn)一步降低。結(jié)合CRISPR/Cas9敲除結(jié)果得出結(jié)論,沉默子區(qū)域的非編碼突變降低了NOTCH1的表達(dá)。綜上所述,本研究通過對兩個(gè)單純型TOF家系進(jìn)行全基因組測序,對編碼區(qū)和非編碼功能區(qū)變異進(jìn)行注釋和篩選,嘗試探索了調(diào)控元件中非編碼突變和編碼突變的復(fù)合雜合遺傳模式與TOF發(fā)病的關(guān)系,并且通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該非編碼區(qū)域和相應(yīng)突變的功能效應(yīng)。結(jié)果表明,這種復(fù)合雜合突變可以增加TOF的外顯率,本研究結(jié)果為TOF遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了新的線索。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文值對候選基因進(jìn)行排序，，最終確定先證者最優(yōu)先致病基因和致病突變。先前已報(bào)道了 6 個(gè)明確的 TOF（OMIM＃187500）致病基因: GATA6，GDF1，JAG1，NKX2-5，TBX1，ZFPM2[42]，我們將這 6 個(gè)基因列為訓(xùn)練集基因，使用ToppGene 基于訓(xùn)練集基因的功能相似性對先證者的目標(biāo)候選基因進(jìn)行識別和優(yōu)先排序。本研究使用的 ToppGene 訓(xùn)練參數(shù)設(shè)置為：GO: molecular function, GO:biological process, GO: cellular component, human phenotype, mouse phenotype,pathway, PubMed, disease 的 FDR 校正 P 值臨界值 0.05，gene limits 1-2,000，檢測參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。篩選致病變異分析流程如圖 1 所示。

17圖 2. CRISPR/Cas9 區(qū)域敲除該圖顯示 CRISPR/Cas9 敲除系統(tǒng)的基因組編輯結(jié)果。A：敲除區(qū)域和非編碼突變位置，以及CRISPR/Cas9 敲除系統(tǒng)的示意圖。B：凝膠電泳檢測不同克隆中基因編輯結(jié)果。C：Sanger測序驗(yàn)證基因組序列，包括純合克隆的反義序列。2.2.10 細(xì)胞 RNA 提取和質(zhì)檢通過 TRIzol LS 試劑從 HEK293T 細(xì)胞中提取總 RNA。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）收集 HEK293T 細(xì)胞，胰酶消化，3000×g 離心 5min，PBS 洗滌兩次。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.4

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本文編號：2596103