【摘要】：細胞重編程技術的重大突破為研究人類發(fā)育和疾病搭建了新的體外平臺,更為個體化細胞治療提供了新的策略,是發(fā)育生物學領域的巨大革新。解決安全性問題是重編程細胞走向臨床應用的前提和關鍵。本研究利用游離型載體技術將WAS綜合征(Wiskott-Aldrich Syndrome, WAS)患者的成纖維細胞重編程為安全的無整合誘導性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSCs)。這些WAS特異性iPSCs可在體外誘導分化為血液細胞,并顯示疾病相關表型,因此可作為WAS的體外研究平臺。更為重要的是,我們對TALEN介導的WAS基因同源重組策略進行了優(yōu)化,可對iPSCs基因組高效編輯,從而得到糾正WAS基因的患者特異性iPSCs本研究將為再生醫(yī)學替代細胞iPSCs的安全獲得和安全基因操作提供典范。 第一章WAS綜合征特異性無整合誘導性多能干細胞株的建立和鑒定 WAS綜合征是由WAS基因發(fā)生功能缺失型突變所導致的x染色體連鎖的免疫缺陷病。WAS蛋白在血液細胞中特異性表達并介導Actin多聚化,是維持正常免疫系統(tǒng)功能不可或缺的重要因子。為建立WAS綜合征的體外研究模型,我們利用表達OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28和TP53shRNA的游離型載體重編程WAS綜合征患者成纖維細胞。我們所建立的WAS綜合征特異性iPSCs (WAS-iPSCs)在形態(tài)學與基因表達模式上均與正常人胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)相似,且表達完全重編程特異性標志Tra-1-60和Tra-1-81。PCR分析和基因測序結果顯示這些WAS-iPSC克隆不含任何重編程載體DNA殘留,且均攜帶患者WAS基因突變,為安全無整合的iPSCs,可用作體外疾病模擬及后續(xù)基因操作。 第二章WAS-iPSCs體外造血分化及疾病表型鑒定 iPSCs的體外定向分化為研究正常生理發(fā)育及疾病進展創(chuàng)造了體外研究平臺。為了證實WAS綜合征疾病相關表型可在體外模擬,我們利用基質細胞共培養(yǎng)法誘導WAS-iPSCs造血分化。在GM-CSF和M-CSF的作用下,我們從分化體系中成功分離并擴增了CD45+CD43+CD11c+造血祖細胞,后者可在甲基纖維素培養(yǎng)基中分化形成CFU-G、CFU-M和CFU-GM等集落形成單位。為研究成熟免疫細胞功能,我們利用相關細胞因子進一步分化得到CD11c+CD14+CD163+巨噬細胞。我們通過體外實驗證實WAS-iPSCs來源的巨噬細胞具有抗原攝取與處理能力、吞噬作用、趨化作用等巨噬細胞經(jīng)典生物學行為。同時,我們通過免疫熒光染色觀察到WAS-iPSCs來源的巨噬細胞由于WAS蛋白功能不全所導致的足體結構形成缺陷。綜上,本研究所建立的WAS-iPSCs克隆為研究WAS蛋白在血液免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用提供了理想的體外模型,經(jīng)過基因糾正后,將為WAS綜合征患者的干細胞基因治療提供無限細胞來源。 ‘第三章TALEN介導的WAS基因高效靶向編輯 對患者來源iPSCs的病變基因進行安全高效的修復是個體化干細胞基因治療的關鍵。轉錄激活子樣效應因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)介導的基因靶向編輯是目前哺乳動物基因組改造最有前景的策略之一。但是,TALEN的優(yōu)化設計方案、以及TALEN表達質粒與基因編輯模板的細胞導入方案還沒有很好地建立。因此TALEN介導的基因靶向編輯效率普遍較低。本研究針對WAS基因6號內(nèi)含子高突變位點設計了一系列TALEN組合,并探討了TALEN靶序列和spacer長度對靶向基因剪切效率的影響,從而優(yōu)化了TALEN的設計方案。同時,我們采用整合酶缺陷型慢病毒載體(Integration-defective Lentiviral Vectors, IDLVs)作為基因編輯模板的導入手段,使TALEN介導的靶向基因編輯效率大幅提高。本研究為實現(xiàn)人iPSCs的高效基因改造提供了新的優(yōu)化策略。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R725.5

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