【摘要】：自2005年瑞典科學(xué)家Allander等人首次在呼吸道感染患兒的鼻咽吸出物中發(fā)現(xiàn)人博卡病毒(Human bocavirus, HBoV)以來,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的HBoV基因型別—HBoV2～4。這些病毒屬于細(xì)小病毒科(Parvoridae)細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)的博卡病毒屬(Bocavirus),是迄今發(fā)現(xiàn)的繼細(xì)小病毒B19之后能感染人的第二類細(xì)小病毒。HBoV在世界各地均有報(bào)道,許多國(guó)家已經(jīng)報(bào)道了在不同標(biāo)本中(如呼吸道標(biāo)本、糞便、血清等)檢測(cè)出HBoVs,旦絕大部分的研究是針對(duì)HBoV1,對(duì)HBoV2～4的研究報(bào)道還很有限。從現(xiàn)有的資料來看,越來越多的臨床證據(jù)支持HBoVl為下呼吸道感染的致病病毒,而HBoV2～4主要在腹瀉患兒的糞便標(biāo)本中檢出,這些感染腸道的HBoVs尤其是HBoV2在糞便標(biāo)本中的檢出率要高于其它基因型別,提示它們可能與兒童的急性胃腸炎有關(guān)。目前為止,HBoV尚不能體外培養(yǎng),也無動(dòng)物模型建立,阻礙了其復(fù)制機(jī)制及致病機(jī)理的研究。為揭示其復(fù)制機(jī)制,有研究在臨床標(biāo)本中檢測(cè)了HBoV1、3的頭-尾DNA序列和環(huán)狀游離體結(jié)構(gòu),并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了HBoV1的感染性克隆,以繞開上述瓶頸進(jìn)行致病機(jī)理的研究。鑒于腹瀉病在我國(guó)兒童疾病譜中的重要地位,本研究對(duì)HBoV2進(jìn)行了初步研究,以明確其與小兒腹瀉病的可能相關(guān)性；得到了HBoV2包括頭-尾序列在內(nèi)的完整基因組,這是國(guó)際上的首次報(bào)道；并嘗試構(gòu)建HBoV2的感染性克隆,為闡明這一病毒的復(fù)制模式和致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。 首先,為了了解北京地區(qū)急性腹瀉患兒中HBoV2的流行情況并了解這一病毒的基因組特征,收集了2010年11月至2012年10月到首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院門診就診的急性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本1068例,應(yīng)用針對(duì)HBoV2NS1基因的PCR引物進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。選擇2例病毒載量較高的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行HBoV2各基因片段的擴(kuò)增并測(cè)序。將所測(cè)到的序列進(jìn)行拼接后得到接近完整的HBoV2基因組序列并與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,所檢測(cè)的2010年11月至2012年10月期間的1068例糞便標(biāo)本中有24例HBoV2DNA檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性檢出率為2.2%；各年齡組中,3-6月齡患兒中的HBoV2DNA陽(yáng)性檢出率最高,達(dá)3.6%(9/252),其次為6-9月齡(2.5%,5/203)的患兒,小于3月齡和大于3歲(含3歲)的患兒中未檢測(cè)到HBoV2陽(yáng)性標(biāo)本；所檢第一年度中,HBoV2日性檢出率在7月最高,為7.0%(3/43),其次為9月(4.8%,2/41)和6月(4.8%,2/42),1-4月無陽(yáng)性標(biāo)本檢出。第二年度中,HBoV2陽(yáng)性檢出率在9月最高,為4.5%(2/44),其次為7月(4.5%,2/45),11、12月及1-5月無陽(yáng)性標(biāo)本檢出。24例HBoV2檢測(cè)陽(yáng)性的患兒除1例患兒年齡大于2歲以外,其余均為2歲以下兒童。其中5例患兒同時(shí)合并有諾如病毒感染、5例合并有輪狀病毒感染、1例合并有腺病毒感染。經(jīng)測(cè)序得到兩株接近完整的HBoV2基因組序列BJQ19和BJQ390,長(zhǎng)度分別為5273bp和5275bp；序列分析顯示這兩株序列的同源性為99.2%,與GenBank中來自中國(guó)上海的FJ375129株同源性最高,分別為99.1%和99.2%,為典型的HBoV2。上述結(jié)果表明,北京地區(qū)部分兒童的急性腹瀉可能與HBoV2感染相關(guān),且HBoV2感染在低年齡組腹瀉兒童中更為常見。 其次,為了明確HBoV2基因組是否存在頭-尾相接的環(huán)狀游離體結(jié)構(gòu),進(jìn)一步對(duì)已確證為HBoV2(?)日性的24例急性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本進(jìn)行了頭尾序列的測(cè)定。第一年度,通過巢式PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2例標(biāo)本有預(yù)期目的條帶,經(jīng)測(cè)序證實(shí)其中1例(BJQ435)為HBoV2頭-尾序列陽(yáng)性標(biāo)本,隨后對(duì)各個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序得到了HBoV2完整的環(huán)狀基因組,標(biāo)記為HBoV2-C1(GenBank序列號(hào)為JX257046)。第二年度,檢出2例HBoV2頭-尾序列陽(yáng)性標(biāo)本(Q1032和Q1089)并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。HBoV2-C1全長(zhǎng)含5307個(gè)核苷酸,含4個(gè)開放讀碼框(Open Reading Frame, ORF)依次含1923、648、2004、1617個(gè)核苷酸,分別編碼NS1、NP1、VP1(?)口VP2蛋白�；蚪M兩端即在VP1/VP2和NS1基因之間有520個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼區(qū)(Non-coding region, NCR),在HBoV2-C1末端連接頭尾的序列中有約50個(gè)核苷酸是在以往報(bào)告的HBoV末端序列中未發(fā)現(xiàn)過的,是本研究的新發(fā)現(xiàn)。對(duì)BoV2-C1和HBoV3-E1(JN086998)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,與HBoV3-E1相比,HBoV2-C1的“發(fā)卡結(jié)構(gòu)2”更為復(fù)雜,其帶有一個(gè)額外的兔耳樣結(jié)構(gòu)；另外一個(gè)主要的不同是,HBoV2-C15'末端結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)比文獻(xiàn)報(bào)道的HBoV3-E1的分布更為分散。上述結(jié)果表明HBoV2基因組存在含頭-尾序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu),這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于這一病毒的復(fù)制機(jī)制補(bǔ)充了新的資料。 最后,在得到HBoV2環(huán)狀基因組的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了HBoV2全基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建策略如下：①將基因組插入到適當(dāng)?shù)妮d體中,利用限制性內(nèi)切酶將基因組切割下來,經(jīng)凝膠電泳純化后在體外使之自我環(huán)化,獲得環(huán)狀基因組。②設(shè)計(jì)含合適酶切位點(diǎn)的引物,利用擴(kuò)增片段兩端的酶切位點(diǎn)和載體自身的酶切位點(diǎn),將其基因組分段依次插入到同一載體。將整個(gè)基因組分為4個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增,其中采用重疊延伸PCR擴(kuò)增得到了含頭-尾序列的第四個(gè)片段HBoV2-4,并將各個(gè)片段插入到pGEM-T Easy載體得到了各個(gè)片段的重組質(zhì)粒,然后通過酶切、連接反應(yīng)及重疊延伸PCR擴(kuò)增的方法將其余3個(gè)片段(HBoV2-1, HBoV2-2, HBoV2-3)拼接在一起,得到了含HBoV2-1+2+3片段的重組質(zhì)粒。HBoV2-1+2+3和HBoV2-4經(jīng)測(cè)序證實(shí)為HBoV2序列。全基因組的重組質(zhì)粒仍在構(gòu)建當(dāng)中。 綜上所述,本研究進(jìn)行了北京地區(qū)急性腹瀉患兒中HBoV2的流行情況的初步調(diào)查并對(duì)這一病毒的基因組特征進(jìn)行了分析；完成了HBoV2完整的基因組序列的測(cè)定分析,報(bào)道了HBoV2基因組存在頭-尾相接的環(huán)狀結(jié)構(gòu),這是國(guó)際上的首次報(bào)道；并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了HBoV2-1+2+3片段和HBoV2-4片段的重組質(zhì)粒。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究HBoV2與兒童腹瀉的關(guān)系及其致病機(jī)理打下了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2267311