本文關鍵詞：氯化鈷在BMSCs修復HIBD認知功能中的作用

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【摘要】：第一部分建立CoCl_2激活BMSCs的HIF-1信號系統(tǒng)的最佳藥物濃度及HIF-1抑制劑2-ME2在BMSCs分泌效應中的作用 目的建立氯化鈷（CoCl_2）藥物濃度水平與BMSCs的HIF-1蛋白水平、增殖指標MTS以及損傷指標LDH水平的效應曲線。以VEGF、EPO、IGF-1蛋白水平為效應指標，論證HIF-1穩(wěn)定劑及HIF-1抑制劑2-ME2在BMSCs分泌效應中的作用，并確定BMSCs分泌蛋白的時間劑量曲線。尋求CoCl_2激活BMSCs的HIF-1a信號系統(tǒng)的最佳藥物濃度。1 方法分離培養(yǎng)BMSCs并用0、10、25、50、100M CoCl_2干預12h、24h、36h、48h后采用LDH檢測BMSCs毒性和MTS檢測BMSCs增殖情況；采用ELISA檢測CoCl_2及HIF-1抑制劑2-ME2在BMSCs分泌VEGF、EPO、IGF-1中的作用；采用westernblot檢測25M CoCl_2干預BMSCs6h、12h、24h、36h后HIF-1蛋白的表達趨勢。 結果（1）LDH檢測結果顯示不同藥物濃度的CoCl_2在0-48h之間對細胞毒性影響無統(tǒng)計學意義(p0.05)。（2）MTS檢測結果顯示不同藥物濃度的CoCl_2在0-48h之間對細胞增殖的影響無統(tǒng)計學意義(p0.05)。（3）CoCl_2作用BMSCs后，分泌蛋白的時間劑量效應關系：10M CoCl_2在48h內(nèi)不能有效促進BMSCs分泌VEGF，25MCoCl_2在36h內(nèi)隨著作用時間的增加VEGF表達也增多，36h表達量最多；在12h時，隨著劑量的增加EPO蛋白表達增加，100M達到最大；各藥物濃度在作用BMSCs12h、36h、48h后，IGF-1蛋白的表達與對照組比較無明顯的差異（p0.05）。（4）CoCl_2作用BMSCs后，westernblot檢測HIF-1蛋白表達的時間效應，36h HIF-1蛋白表達比其它各組都多（p0.05）。（5）CoCl_2促進BMSCs分泌生長因子的效應可被HIF-1抑制劑抑制。25M CoCl_2培養(yǎng)液中加入1M、2.5M、5M2-ME2后VEGF、EPO、IGF-1表達都明顯降低（p0.01），且在2.5M2-ME2作用下VEGF、EPO、IGF-1表達最低。 結論（1）（0-100uM）CoCl_2作用BMSCs12h、24h、36h、48h后對細胞沒有明顯的毒性作用。（2）（0-100uM）CoCl_2對BMSC作用12h、24h、36h、48h后對細胞增殖沒有明顯的影響。（3）CoCl_2能促進BMSCs分泌生長因子，25M CoCl_2作用BMSCs36h為促進VEGF、EPO、IGF-1蛋白表達的最適條件。（4）2-ME2可抑制CoCl_2促進BMSCs分泌生長因子的作用，2.5M2-ME2為抑制25M CoCl_2作用BMSCs36h條件下VEGF和EPO表達的最適濃度。 第二部分探討B(tài)MSCs條件培養(yǎng)基改善HIBD大鼠認知功能中的作用 目的建立新生大鼠培養(yǎng)基持續(xù)腦室內(nèi)灌注的技術手段以及探討B(tài)MSCs條件培養(yǎng)基改善HIBD大鼠認知功能中的作用。 方法生后7日齡HIBD大鼠40只。隨機分為培養(yǎng)基對照組（DMEM組，n=8)、骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液組（BMSCs-DMEM組，n=8）、CoCl_2作用骨髓間充質(zhì)干細胞后的培養(yǎng)基上清液組（CoCl_2-DMEM組，n=8）、CoCl_2作用下的骨髓間充質(zhì)干細胞以及培養(yǎng)基上清液組（CoCl_2-DMEM+BMSCs組，n=8）、CoCl_2和2-ME2共同作用骨髓間充質(zhì)干細胞后的培養(yǎng)基上清液組（CoCl_2+2-ME2-DMEM組，n=8）。收集濃縮相應的培養(yǎng)基并通過Alzet微型真空泵的方式連續(xù)7天注入10日齡HIBD大鼠左側腦室。大鼠生后7周行Morris水迷宮觀察CoCl_2對大鼠空間學習記憶能力的影響;大鼠生后8周通過HE、尼氏染色對各組進行病理學觀察； ELISA定量檢測腦組織VEGF、EPO、IGF-1水平；采用神經(jīng)電生理技術檢測各組HIBD大鼠海馬腦片LTP誘發(fā)；免疫熒光檢測各組HIBD大鼠的突觸可塑性關鍵指標AMPA受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionatereceptor, AMPAR)的GluR2亞基的表達情況。 結果（1）各組HIBD大鼠在持續(xù)7天腦室內(nèi)灌注條件培養(yǎng)基后的一般情況：攝食、睡眠情況良好，毛發(fā)光亮，行為活動無異常，精神可。（2）水迷宮行為學測試觀察條件培養(yǎng)基對HIBD大鼠認知功能的作用：CoCl_2-DMEM組和CoCl_2-DMEM+BMSCs組與DMEM組比較,平均潛伏期均明顯縮短，穿越平臺區(qū)域的時間增加，空間學習記憶能力部分恢復(P 0.01)。（3）組織病理學HE染色以及尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)DMEM組和BMSCs-DMEM組較CoCl_2-DMEM組大鼠海馬區(qū)結構紊亂，神經(jīng)細胞損傷嚴重。 CoCl_2-DMEM組異常細胞數(shù)較CoCl_2+BMSCs-DMEM組多(P 0.01)。（4）采用ELISA探討腦組織中生長因子的分泌情況，，CoCl_2-DMEM組VEGF、IGF-1表達較DMEM組和BMSCs-DMEM組高（p 0.01）。CoCl_2-DMEM+BMSCs組較CoCl_2-DMEM組高（p 0.01），在2-ME2作用下，腦組織中VEGF、IGF-1表達都降低。（5）CoCl_2處理能增加LTP誘發(fā)率。CoCl_2-DMEM組較DMEM組和BMSCs-DMEM組誘發(fā)率增高，CoCl_2-DMEM+BMSCs組最高。（6）通過GluR2免疫熒光探討LTP分子機制。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DMEM組和BMSCs-DMEM組大鼠海馬區(qū)GluR2表達較CoCl_2-DMEM組和CoCl_2+BMSCs-DMEM組少(P0.01)。CoCl_2+BMSCs-DMEM組較CoCl_2-DMEM組GluR2表達多(P0.01)。CoCl_2+2-ME2-DMEM組比CoCl_2-DMEM組少(P 0.01)。 結論(1) CoCl_2能有效改善HIBD的空間學習記憶能力，2-ME2能抑制其發(fā)揮此作用。（2） CoCl_2作用的條件培養(yǎng)基與BMSCs可更好促進HIBD大鼠海馬區(qū)結構和神經(jīng)細胞損傷后的修復，二者發(fā)揮協(xié)同作用。（3）CoCl_2可以促進HIBD大鼠腦組織分泌VEGF、IGF-1等神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮功能修復作用。（4）CoCl_2處理能增加LTP誘發(fā)率。（5）從分子機制上驗證CoCl_2處理能調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉劍;譚榮;胡坤娥;;打擊型腦外傷動物模型的研究進展[J];中日友好醫(yī)院學報;2013年06期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 肖湘;難治/復發(fā)急性髓系白血病線粒體ATP合酶β亞單位（ATPsyn-β）水平的變化及與白血病耐藥、預后關系的研究[D];中南大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮冠軍;NT-3聯(lián)合NSCs移植對乳鼠HIBD修復作用[D];石河子大學;2013年

本文編號：1273383