為了建立一種豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus,PSV)TaqMan實時熒光定量PCR方法,試驗根據GenBank中6株PSV的基因組序列設計合成特異性引物和探針,優(yōu)化擴增體系和程序,并完成敏感性試驗、特異性試驗、重復性試驗及PSV陽性樣品的檢測。結果表明:優(yōu)化后的特異性引物和探針濃度均為0.8μmol/L、退火溫度為55℃;建立的PSV TaqMan實時熒光定量PCR方法的最低檢測限為5×10～1拷貝/μL,TaqMan實時熒光定量PCR方法的敏感性比普通PCR方法高100倍;僅以PSV陽性質粒為模板進行的TaqMan實時熒光定量PCR檢測有擴增曲線,其他對照病毒樣品均未發(fā)生擴增;組間與組內變異系數均低于1%;對30份陽性病料進行檢測,擴增結果均為陽性。說明試驗建立的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法敏感性、特異性、重復性好,可用于PSV的臨床檢測。

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【部分圖文】：

圖1 重組質粒的酶切鑒定結果

2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,得到大小為143bp的目的片段(見圖1),與預期大小一致。經測序比對,PSV目的片段克隆成功。經測定質粒濃度為154.39ng/μL,根據公式計算質�？截悢禐�5.00×1010拷貝/μL,將質粒于-20℃保存,作為標準品質粒用于后續(xù)試驗。

圖2 標準曲線

對按梯度稀釋的標準品質粒進行擴增,繪制標準曲線(見圖2)。標準曲線的相關系數(R2)=0.98,擴增效率(E)=0.97,標準曲線斜率為-3.395,截距為40.07,標準曲線的線性關系表達式為y=-3.395x+40.07。3.4敏感性試驗

圖3 敏感性試驗結果

目前檢測PSV的方法主要有病原學檢測、分子生物學鑒定。病原學檢測即是對病毒進行細胞培養(yǎng)后通過電鏡觀察分析病毒粒子形態(tài)學結構,目前PSV的嗜性細胞有豬腎細胞(IBRS-2)、乳倉鼠腎細胞(BHK-21)、豬腎貼壁細胞(LLC-PK)等[5-6],由于PSV對細胞培養(yǎng)條件的要求較嚴苛....

圖4 特異性試驗結果

圖3敏感性試驗結果

本文編號：4047031