C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens Type C）可感染豬、馬、牛、羊等各種家畜，3日齡內(nèi)新生仔豬最易感，俗稱仔豬紅痢，病死率高，嚴(yán)重威脅我國的家畜養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α、β1和β2三種毒素，其中α毒素具有細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性，是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌一種重要的毒力因子。目前對于C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的紅痢的防治，主要采取的措施是給懷孕母豬于產(chǎn)前肌肉注射C型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗，仔豬出生后喂食初乳，從而獲得被動(dòng)免疫保護(hù)，同時(shí)與青霉素、土霉素等抗生素類藥物聯(lián)合使用，以達(dá)到治療的效果。臨床上對于抗體類藥物的使用較少，因?yàn)橐话愕目贵w類藥物成本較高。近年來，卵黃抗體（IgY）通過口服等途徑來被動(dòng)保護(hù)哺乳動(dòng)物疾病的研究增加，由于禽類與哺乳動(dòng)物物種距離較遠(yuǎn)，對哺乳動(dòng)物高保守蛋白具有強(qiáng)反應(yīng)性，且IgY產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)成本較低，制備簡單，因此在預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物消化道等疾病方面具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢和廣闊的市場空間。本實(shí)驗(yàn)對C型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，生產(chǎn)抗α毒素的特異性IgY抗體，為以后臨床低成本抗體藥物的研制奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容分為以下3個(gè)部...

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特點(diǎn)
        1.1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體形態(tài)特征
        1.1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體培養(yǎng)特征
        1.1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體的生化特征及抵抗力
    1.2 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力因子
        1.2.1 α毒素（CPA）
        1.2.2 β1 毒素（CPB1）
        1.2.3 β2 毒素（CPB2）和β2 毒素編碼基因（cpb2）
    1.3 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)理
        1.3.1 α毒素（CPA）的致病機(jī)理
        1.3.2 β1 毒素（CPB1）的致病機(jī)理和作用部位
    1.4 IgY 技術(shù)在畜禽胃腸道疾病中的應(yīng)用
        1.4.1 IgY 用于防治幼畜細(xì)菌性和病毒性腹瀉
        1.4.2 IgY 用于防治禽細(xì)菌性和病毒性疾病
    1.5 本研究的目的及意義
第二章 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白原核表達(dá)和純化
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與載體
        2.1.2 工具酶和試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 所用溶液及培養(yǎng)基的配制
    2.2 方法
        2.2.1 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組的提取
        2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2.3 α毒素基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.2.4 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.5 重組 T-Vector pMD19-α的克隆
        2.2.6 重組 T-Vector pMD19-α的鑒定
        2.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-α的構(gòu)建與鑒定
        2.2.8 pET-32a-α的 BL 21（DE3）表達(dá)菌的構(gòu)建
        2.2.9 表達(dá)蛋白的 Western blot 分析
        2.2.10 包涵體蛋白的純化
        2.2.11 包涵體蛋白的復(fù)性
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.3.2 T-Vector pMD19-α的酶切鑒定
        2.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-α的構(gòu)建及鑒定
        2.3.4 α毒素蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定
        2.3.5 α毒素蛋白 IPTG 誘導(dǎo)濃度的確定
        2.3.6 α毒素蛋白的 Western blot 分析
        2.3.7 α毒素重組蛋白的純化
        2.3.8 α毒素重組蛋白的復(fù)性
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 抗 C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白特異性 IgY 抗體的制備
    3.1 材料
        3.1.1 試劑
        3.1.2 溶液配制
    3.2 方法
        3.2.1 免疫原制備及免疫
        3.2.2 IgY 抗體提取和鑒定
        3.2.3 間接 ELISA 檢測 IgY 抗體效價(jià)
        3.2.4 IgY 抗體的 Western blot 鑒定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 IgY 抗體的 SDS-PAGE 電泳
        3.3.2 抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化
        3.3.3 Western blot 鑒定
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：4044076