本研究利用CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)建立了火雞皰疹病毒的載體平臺(tái),并拯救獲得在US2或US10基因內(nèi)表達(dá)外源基因的重組火雞皰疹病毒。首先根據(jù)HVT FC-126毒株US2基因序列,設(shè)計(jì)并合成g RNA,并通過(guò)雙鏈退火的方式,獲得目的片段。目的片段與Bbs1酶切處理后的px330載體連接,獲得重組質(zhì)粒px330-gRNA。通過(guò)PCR的方法,分別擴(kuò)增獲得US2的g RNA序列兩側(cè)的同源臂A(US2A)和B(US2B)及EGFP編碼蛋白的序列,并通過(guò)PCR的方法,擴(kuò)增獲得US2A-EGFP-US2B片段。將px330-g RNA和US2A-EGFP-US2B電轉(zhuǎn)入雞胚成纖維細(xì)胞。24h后,將電轉(zhuǎn)的細(xì)胞感染HVT FC-126。感染后72h,收集較大熒光簇的細(xì)胞。進(jìn)一步地將收集的細(xì)胞團(tuán)稀釋成一定的濃度并接種于新的雞胚成纖維細(xì)胞。通過(guò)蝕斑純化的方法,最終獲得了穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒rHVT-US2-EGFP。用同樣的方法,也獲得了穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒rHVT-US10-EGFP。這些研究結(jié)果建立了HVT重組表達(dá)載體系統(tǒng),為后期的拯救穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白HVT重組病毒及其應(yīng)用研究奠定...

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略語(yǔ)表
1 引言
    1.1 馬立克氏病病毒與火雞皰疹病毒的概述
        1.1.1 馬立克氏病病毒與火雞皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)及形態(tài)
        1.1.2 馬立克氏病病毒與火雞皰疹病毒的復(fù)制
    1.2 疫苗的概述
    1.3 火雞皰疹病毒作為病毒載體的優(yōu)點(diǎn)
    1.4 火雞皰疹病毒作為活病毒載體的條件
        1.4.1 構(gòu)建外源基因表達(dá)盒
        1.4.2 復(fù)制非必需區(qū)的選擇
        1.4.3 啟動(dòng)子的選擇
        1.4.4 重組火雞皰疹病毒的研究進(jìn)展
    1.5 同源重組技術(shù)
        1.5.1 同源重組技術(shù)的概況
        1.5.2 同源重組技術(shù)的發(fā)展歷史
    1.6 CRISPR系統(tǒng)的介紹
        1.6.1 CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.6.2 CRISPR系統(tǒng)的類(lèi)型
        1.6.3 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的介紹
        1.6.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.7 本試驗(yàn)研究目的意義
2 表達(dá)EGFP的重組火雞皰疹病毒rHVT-US2-EGFP的拯救與鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 病毒與質(zhì)粒
        2.1.2 細(xì)胞與雞胚
        2.1.3 主要試劑與試劑盒
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 方法
        2.2.1 設(shè)計(jì)引物
        2.2.2 px330-gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.1 gRNA雙鏈退火
            2.2.2.2 px330質(zhì)粒的BbsⅠ單一酶切
            2.2.2.3 酶切產(chǎn)物與雙鏈退火引物快速鏈接
            2.2.2.4 轉(zhuǎn)化與菌液鑒定
            2.2.2.5 陽(yáng)性質(zhì)粒的大量抽提
        2.2.3 重組質(zhì)粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的構(gòu)建
            2.2.3.1 含US2基因左右臂的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.3.2 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)制備步驟
            2.2.3.3 火雞皰疹病毒細(xì)胞毒的凍存與復(fù)蘇
            2.2.3.4 火雞皰疹病毒的增殖
            2.2.3.5 火雞皰疹病毒的DNA的提取
            2.2.3.6 US2基因左右臂的擴(kuò)增
            2.2.3.7 目的片段的純化
            2.2.3.8 目的片段與pSIMPLE19EcoRV/BAPVector載體的連接
            2.2.3.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定
            2.2.3.10 陽(yáng)性質(zhì)粒小量提取及測(cè)序
            2.2.3.11 US2基因左右同源臂的擴(kuò)增
            2.2.3.12 pUC19-EGFP表達(dá)載體質(zhì)粒的線性化
            2.2.3.13 pUC19-EGFP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的純化
            2.2.3.14 載體與目的片段進(jìn)行同源重組
            2.2.3.15 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的PCR鑒定
            2.2.3.16 線性化同源重組臂
        2.2.4 共轉(zhuǎn)染
            2.2.4.1 次代雞胚成纖維細(xì)胞中脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染
            2.2.4.2 人腎上皮細(xì)胞中脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染
            2.2.4.3 電轉(zhuǎn)染法
            2.2.4.4 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
            2.2.4.5 重組病毒rHVT-US2-EGFP的篩選
            2.2.4.6 US2重組病毒的鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 px330質(zhì)粒BbsⅠ酶切電泳結(jié)果
        2.3.2 px330-gRNA菌液鑒定結(jié)果
        2.3.3 US2左右臂菌液鑒定結(jié)果
        2.3.4 pUC19-EGFP質(zhì)粒雙酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.5 US2基因的左右同源臂擴(kuò)增電泳結(jié)果
        2.3.6 線性化重組質(zhì)粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果
        2.3.7 電壓的優(yōu)化
        2.3.8 細(xì)胞量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.10 US2重組病毒的拯救及蝕斑純化結(jié)果
        2.3.11 US2重組病毒的鑒定結(jié)果
3 表達(dá)EGFP的兩株重組火雞皰疹病毒rHVT-US10-EGFP的拯救與鑒定
    3.1 材料
    3.2 方法
        3.2.1 設(shè)計(jì)引物
        3.2.2 px330-gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.2.1 gRNA雙鏈退火
            3.2.2.2 px330質(zhì)粒的BbsⅠ單一酶切
            3.2.2.3 酶切產(chǎn)物與雙鏈退火引物快速連接
            3.2.2.4 轉(zhuǎn)化與菌液鑒定
            3.2.2.5 陽(yáng)性質(zhì)粒的大量抽提
        3.2.3 重組質(zhì)粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的構(gòu)建
            3.2.3.1 US10基因左右臂的擴(kuò)增
            3.2.3.2 US10基因左右同源臂的擴(kuò)增
            3.2.3.3 載體與目的片段進(jìn)行同源重組
            3.2.3.4 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒的PCR鑒定
            3.2.3.5 線性化同源重組臂
        3.2.4 電轉(zhuǎn)染
        3.2.5 重組病毒rHVT-US10-EGFP的篩選
        3.2.6 US10重組病毒的鑒定
        3.2.7 結(jié)果
            3.2.7.1 px330-gRNA菌液鑒定結(jié)果
            3.2.7.2 US10左右同源臂菌液鑒定結(jié)果
            3.2.7.3 US10左右同源臂擴(kuò)增電泳圖結(jié)果
            3.2.7.4 線性化重組質(zhì)粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果
            3.2.7.5 US10重組病毒的拯救與蝕斑純化結(jié)果
            3.2.7.6 US10重組病毒的鑒定結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：4039987