腸毒素大腸桿菌(ETEC)是一種重要的腹瀉致病菌,在發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒及到這些國(guó)家的旅游者的腹瀉疾病中尤為多見。傳統(tǒng)臨床防治中隨著菌株耐藥性增強(qiáng),抗生素的使用效果愈不如人意,而外源提供特異性卵黃抗體具有安全、無(wú)抗藥性、制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),成為一種具有廣闊應(yīng)用前景的抗生素替代品。另一方面在ETEC感染過(guò)程中,粘附是致病的首要條件,如何阻斷粘附進(jìn)而防止腹瀉的發(fā)生是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。近期研究發(fā)現(xiàn)兩類非菌毛粘附素即鞭毛蛋白FliC和介導(dǎo)FliC與上皮細(xì)胞粘附的EtpA,兩者在人源ETEC粘附上皮過(guò)程中起重要作用,并且這種新的粘附機(jī)制具有一定的普遍性。本研究利用構(gòu)建的原核表達(dá)載體,得到FliC與EtpA蛋白,并在免疫蛋雞后獲得特異性卵黃抗體,并對(duì)卵黃抗體體外特性進(jìn)行研究,通過(guò)建立小鼠腸道定植模型,驗(yàn)證IgY的抗粘附效果。旨在為今后廣譜性抗ETEC腹瀉卵黃抗體的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1.以人源腸毒素大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H10407為試驗(yàn)材料,將PCR擴(kuò)增后的目的片段連接至表達(dá)載體,成功構(gòu)建了在細(xì)菌粘附上皮細(xì)胞過(guò)程中的關(guān)鍵基因etp4和鞭毛基因fliC以及二者融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒,其中融合基因之間以一...

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)表
文獻(xiàn)綜述
    1 前言
    2 腸毒素大腸桿菌腹瀉及其防治
        2.1 腸毒素大腸桿菌生物學(xué)特性
        2.2 腸毒素大腸桿菌腹瀉的流行病學(xué)
        2.3 腸毒素大腸桿菌致病機(jī)理
            2.3.1 菌毛粘附素(Fimbrial adhesins)
            2.3.2 非菌毛粘附素(Non-fimbrial adhesins)
            2.3.3 腸毒素
        2.4 腸毒素大腸桿菌腹瀉的防治
            2.4.1 腸毒素大腸桿菌的臨床癥狀與鑒定
            2.4.2 防治ETEC腹瀉的疫苗研究進(jìn)展
            2.4.3 臨床治療
    3 卵黃抗體的研究進(jìn)展
        3.1 發(fā)現(xiàn)和發(fā)展
        3.2 分子結(jié)構(gòu)
        3.3 生物化學(xué)性質(zhì)
            3.3.1 理化性質(zhì)
            3.3.2 卵黃抗體的穩(wěn)定性
            3.3.2 卵黃抗體在應(yīng)用上的優(yōu)點(diǎn)
        3.4 分離純化方法
        3.5 IgY應(yīng)用的研究進(jìn)展
            3.5.1 IgY在動(dòng)物疾病上的研究進(jìn)展
            3.5.2 IgY在人類食品和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
        3.6 制備IgY免疫原的選擇
    4 研究目的和意義
試驗(yàn)一 腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白和EtpA的克隆表達(dá)
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 主要試劑和試劑盒
        2.4 溶液配制
            2.4.1 細(xì)菌DNA提取相關(guān)溶液
            2.4.2 培養(yǎng)基
            2.4.3 DNA凝膠電泳相關(guān)溶液
            2.4.4 SDS-PAGE電泳相關(guān)溶液
            2.4.5 包涵體純化相關(guān)試劑
        2.5 實(shí)驗(yàn)方法
            2.5.1 細(xì)菌DNA的提取
            2.5.2 引物設(shè)計(jì)
            2.5.3 PCR擴(kuò)增目的基因
            2.5.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與回收
            2.5.5 DNA片段的克隆
            2.5.6 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒
            2.5.7 誘導(dǎo)表達(dá)
            2.5.8 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白
            2.5.9 包涵體復(fù)性
    3 結(jié)果與分析
        3.1 PCR擴(kuò)增目的片段
        3.2 構(gòu)建目的片段表達(dá)載體
        3.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
            3.3.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.3.2 目的蛋白的可溶性分析
            3.3.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
        3.4 包涵體的提取
    4 討論
        4.1 表達(dá)載體的選擇
        4.2 基因序列對(duì)蛋白表達(dá)的影響
        4.3 誘導(dǎo)條件對(duì)蛋白表達(dá)的影響
    5 小結(jié)
試驗(yàn)二 卵黃抗體的制備與穩(wěn)定性研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 主要儀器設(shè)備
        2.3 試劑
        2.4 溶液配制
            2.4.1 免疫蛋雞相關(guān)試劑
            2.4.2 ELISA相關(guān)試劑
            2.4.3 western-blot相關(guān)試劑
        2.5 試驗(yàn)方法
            2.5.1 蛋白油乳苗的制備
            2.5.2 免疫蛋雞
            2.5.3 間接ELISA測(cè)定卵黃抗體效價(jià)
            2.5.4 western-blot檢測(cè)蛋白免疫原性
            2.5.5 卵黃抗體的純化
            2.5.6 制備噴霧干燥全蛋粉
            2.5.7 卵黃抗體的熱穩(wěn)定性研究
            2.5.8 卵黃抗體的酸穩(wěn)定性研究
            2.5.9 卵黃抗體的酶解穩(wěn)定性研究
    3 結(jié)果與分析
        3.1 最佳抗原包被濃度的確定
        3.2 卵黃抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化規(guī)律
        3.3 抗融合蛋白卵黃抗體的效價(jià)鑒定
        3.4 卵黃抗體的凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定分析
        3.5 Western-Blot鑒定卵黃抗體的特異性
        3.6 IgY穩(wěn)定性研究
            3.6.1 熱穩(wěn)定性
            3.6.2 酸穩(wěn)定性
            3.6.3 酶解穩(wěn)定性
    4 討論
        4.1 卵黃抗體的提純
        4.2 卵黃抗體在蛋雞體內(nèi)產(chǎn)生和發(fā)展規(guī)律
        4.3 IgY的穩(wěn)定性研究
    5 小結(jié)
試驗(yàn)三 卵黃抗體的抗粘附效果研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 菌株
        2.3 試驗(yàn)材料
        2.5 方法
            2.5.1 小鼠攻毒試驗(yàn)
            2.5.2 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
    4 討論
    5 小結(jié)
結(jié)語(yǔ)
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 本研究不足之處
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3865061