豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)屬于α冠狀病毒,可引起仔豬產生急性的、高度接觸性腸道傳染病。PEDV的感染會導致宿主細胞mRNA與miRNA表達水平動態(tài)的變化,并與病毒形成復雜的作用網絡。全面的分析差異表達宿主因子對PEDV復制的調控,有助于完整地掌握病毒感染后細胞組分、生物學功能、信號通路的變化規(guī)律,了解PEDV的致病機制,篩選影響病毒入侵、調控病毒復制的宿主因子。Vero E6細胞是PEDV分離、傳代和進行實驗研究的主要細胞。本研究通過對感染PEDV弱毒株CV777與強毒株LNct2的Vero E6細胞進行RNA高通量測序,分析細胞內mRNA及miRNA的差異表達情況。與對照組相比,CV777感染組篩選出33個差異表達基因,LNct2感染組篩選出1854個差異表達基因,兩組共有的差異基因為16個。miRNA測序結果顯示CV777感染組共產生23個差異表達miRNA,LNct2感染組共產生70個差異表達miRNA,兩組共有的差異表達miRNA為10個。對差異表達的宿主因子進行生物信息學分析,結果顯示差異表達因子主要富集在調控細胞內信號...

【文章頁數】：104 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 豬流行性腹瀉病原學概述
        1.1.1 PEDV結構與生物學特性
        1.1.2 PEDV在中國的流行情況
        1.1.3 PEDV的防控與治療
    1.2 PEDV入侵宿主細胞機制進展
    1.3 冠狀病毒mRNA翻譯機制
        1.3.1 冠狀病毒mRNA翻譯具有Cap結構依賴性
        1.3.2 冠狀病毒IRES介導的翻譯
        1.3.3 宿主與病毒蛋白調節(jié)冠狀病毒mRNA的翻譯
    1.4 轉錄組學概述
    1.5 miRNA研究進展
        1.5.1 miRNA生物學概述
        1.5.2 miRNA的生物合成
        1.5.3 miRNA介導的mRNA降解機制
        1.5.4 miRNA與病毒感染
    1.6 本研究的目的意義
第二章 PEDV感染Vero E6 細胞mRNA/miRNA表達譜分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要實驗試劑
        2.1.2 毒株、細胞和抗體
        2.1.3 主要儀器設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 構建PEDV感染mRNA/miRNA表達譜測序細胞的篩選
            2.2.1.1 間接免疫熒光實驗
            2.2.1.2 半數感染量的測定(TCID₅₀)
            2.2.1.3 熒光定量PCR檢測病毒載量
        2.2.2 PEDV感染細胞mRNA/miRNA高通量測序
        2.2.3 轉錄組測序結果分析
            2.2.3.1 測序質量分析與表達差異分析
            2.2.3.2 差異表達基因功能富集分析
        2.2.4 轉錄組測序結果驗證
            2.2.4.1 RT-qPCR驗證差異表達mRNA變化
            2.2.4.2 RT-qPCR驗證干擾素刺激基因差異表達
            2.2.4.3 Western blot驗證MAPK通路變化
        2.2.5 miRNA表達差異分析
        2.2.6 miRNA高通量測序結果驗證
            2.2.6.1 miRNA提取與反轉錄
            2.2.6.2 miRNA RT-qPCR驗證
    2.3 結果
        2.3.1 PEDV感染靶細胞的篩選
            2.3.1.1 間接免疫熒光實驗
            2.3.1.2 TCID₅₀的測定
            2.3.1.3 熒光定量PCR檢測病毒載量
        2.3.2 轉錄組測序結果分析
            2.3.2.1 轉錄組測序結果整理與質量分析
            2.3.2.2 差異表達mRNA分析
            2.3.2.3 差異表達基因功能GO富集分析
            2.3.2.4 KEGG細胞通路富集分析
        2.3.3 PEDV感染差異表達mRNA驗證
            2.3.3.1 RT-qPCR驗證主要差異表達mRNA
            2.3.3.2 RT-qPCR驗證差異表達ISGs
            2.3.3.3 PEDV感染激活MAPK信號通路
        2.3.4 PEDV感染Vero E6 細胞miRNA表達規(guī)律
            2.3.4.1 原始數據統計及過濾
            2.3.4.2 差異表達miRNA分析
            2.3.4.3 差異表達miRNA候選靶基因GO富集分析
            2.3.4.4 差異表達miRNA候選靶基因KEGG富集分析
        2.3.5 加poly(A)尾法RT-qPCR驗證miRNA測序結果
    2.4 討論
        2.4.1 PEDV感染后差異mRNA表達規(guī)律分析
        2.4.2 miRNA與 mRNA表達譜聯合分析
第三章 Abl2 影響PEDV復制機制研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 細胞、質粒和病毒
        3.1.2 抗體、試劑盒、抑制劑
        3.1.3 敲低Abl2對PEDV復制的影響
            3.1.3.1 RNAi干擾實驗
            3.1.3.2 抑制劑實驗
        3.1.4 抑制劑加入時間對PEDV復制的影響
        3.1.5 IFA檢測PEDV介導的細胞融合
        3.1.6 Abl2對其他豬腸道冠狀病毒感染的影響
    3.2 結果
        3.2.1 siRNA下調Abl2 表達抑制PEDV的增殖
        3.2.2 Abl2 抑制劑可顯著抑制PEDV復制
        3.2.3 Abl2 不影響PEDV吸附過程
        3.2.4 Abl2 影響PEDV復制早期階段
        3.2.5 Imatinb在病毒入侵階段抑制PEDV復制
        3.2.6 Abl2 抑制劑抑制PEDV誘導的合胞體的形成
        3.2.7 Abl2對豬腸道冠狀病毒復制的影響
    3.3 討論
第四章 影響PEDV復制miRNA的篩選及其靶基因的驗證
    4.1 材料和方法
        4.1.1 細胞、毒株和載體
        4.1.2 主要試劑與儀器
        4.1.3 影響PEDV復制差異表達miRNA篩選
        4.1.4 miR-486-5p靶基因的預測
        4.1.5 miR-486-5p靶基因的驗證
            4.1.5.1 雙熒光素酶報告系統檢測miR-486-5p與靶基因3’UTR結合
            4.1.5.2 RNAi干擾靶基因對PEDV復制的影響
        4.1.6 RT-qPCR檢測PEDV感染后SRSF3 mRNA表達水平變化
        4.1.7 敲低SRSF3對PEDV復制的影響
        4.1.8 過表達SRSF3對PEDV復制的影響
            4.1.8.1 SRSF3真核表達載體的構建
            4.1.8.2 SRSF3 轉染Vero E6 細胞
            4.1.8.3 PEDV感染過表達SRSF3 Vero E6 細胞
        4.1.9 激光共聚焦實驗
        4.1.10 免疫共沉淀實驗
    4.2 結果
        4.2.1 影響PEDV復制的差異表達miRNA初步篩選
        4.2.2 miR-486-5p抑制PEDV復制
        4.2.3 miR-486-5p與靶基因互作網絡圖的構建
        4.2.4 miR-486-5p靶基因的驗證
            4.2.4.1 RT-qPCR驗證miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.2 雙熒光素酶報告系統驗證miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.3 敲低miR-486-5p候選靶基因對PEDV復制的影響
        4.2.5 SRSF3在PEDV感染過程中顯著上調
        4.2.6 敲低SRSF3抑制PEDV的復制
        4.2.7 過表達SRSF3促進PEDV的復制
        4.2.8 SRSF3與PEDV N蛋白不發(fā)生相互作用
    4.3 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3800042