副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的成員,為革蘭氏陰性菌,是革拉澤氏病(Glaesser’s Disease)的主要病原菌。研究表明HPS常在與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒等病的病原混合感染時(shí)對(duì)機(jī)體造成免疫抑制,從而加重感染發(fā)病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅到養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。脂蛋白PalA作為HPS的重要毒力因子之一,是細(xì)胞膜脂蛋白與肽聚糖相互作用結(jié)合的一類蛋白,廣泛的存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中,可作為疫苗的候選蛋白。本研究以三株副豬嗜血桿菌四川分離株為材料,進(jìn)行PalA基因PCR擴(kuò)增,構(gòu)建該基因的克隆載體及5型菌株P(guān)alA基因的表達(dá)載體并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 Ⅰ、副豬嗜血桿菌的分離鑒定 對(duì)來自四川省遂寧市模化養(yǎng)殖場(chǎng)中疑似副豬嗜血桿菌(HPS)感染的發(fā)病豬的肺臟等病料組織,做無菌處理后,劃線方式涂布于TSA培養(yǎng)基,挑取菌落形態(tài)特征與副豬嗜血桿菌相似的單個(gè)菌落接種TSA培養(yǎng)基,經(jīng)三次傳代純化后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、染色鏡檢及培養(yǎng)特性檢測(cè)、生化試驗(yàn)、血清型試驗(yàn)等基本生物學(xué)特性研究。 Ⅱ、PalA基因的克隆與序列分析 參照GenBank收錄...

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 文獻(xiàn)綜述
    1.1. 副豬嗜血桿菌研究進(jìn)展
        1.1.1. 病原學(xué)和血清學(xué)研究進(jìn)展
        1.1.2. 基因分型研究
        1.1.3. 細(xì)菌分離鑒定與培養(yǎng)
        1.1.4. 致病機(jī)理
        1.1.5. 副豬嗜血桿菌毒力因子的研究
        1.1.6. 臨床用藥的研究
        1.1.7. 預(yù)防和免疫
    1.2. 生物信息學(xué)在病原研究中的應(yīng)用
    1.3. 課題研究的目的和意義
2. 材料和設(shè)備
    2.1. 試驗(yàn)材料
        2.1.1. 病料
        2.1.2. 試驗(yàn)所涉及的菌株和質(zhì)粒
        2.1.3. 試驗(yàn)所涉及的酶，試劑盒及生化試劑
    2.2. 主要儀器設(shè)備
    2.3. 分析軟件及網(wǎng)站
3. 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
        3.1.1. 培養(yǎng)基的制備
        3.1.2. 細(xì)菌的分離培養(yǎng)
        3.1.3. NAD依賴性試驗(yàn)
        3.1.4. CAMP試驗(yàn)
        3.1.5. 生化試驗(yàn)
        3.1.6. 血清型鑒定
    3.2. PalA基因的克隆
        3.2.1. PalA基因的引物設(shè)計(jì)與合成
        3.2.2. PaLA基因的PCR擴(kuò)增
        3.2.3. PaLA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收
        3.2.4. PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接
        3.2.5. DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl₂法)
        3.2.6. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.7. 重組質(zhì)粒提取
        3.2.8. 重組質(zhì)粒測(cè)序
        3.2.9. 重組質(zhì)粒的雙酶切
    3.3. pET32a-PalA表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.1. 表達(dá)載體pET32a進(jìn)行雙酶切
        3.3.2. 目的片段與載體片段的連接
        3.3.3. 載體質(zhì)粒的修復(fù)轉(zhuǎn)化到DH5α及陽性菌株的篩選
        3.3.4. 表達(dá)載體質(zhì)粒的提取
        3.3.5. 重組質(zhì)粒測(cè)序
        3.3.6. BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl₂法)
        3.3.7. 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
        3.3.8. 陽性檢測(cè)
    3.4. 生物信息學(xué)分析
        3.4.1. ORF的查找分析
        3.4.2. 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析
        3.4.3. 蛋白質(zhì)的疏水性分析
        3.4.4. 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析
        3.4.5. 蛋白質(zhì)的主要抗原域預(yù)測(cè)
        3.4.6. 蛋白質(zhì)的表面可能性預(yù)測(cè)
        3.4.7. 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)
        3.4.8. 氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
        3.4.9. 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.4.10. 序列同源性和相似性搜索
        3.4.11. 多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立
4. 結(jié)果與分析
    4.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
        4.1.1. 細(xì)菌的分離培養(yǎng)特性
        4.1.2. 細(xì)菌的鑒定結(jié)果
        4.1.3. 血清型鑒定
    4.2. HPS四川分離株P(guān)aLA基因的克隆
        4.2.1. PaLA基因的PCR擴(kuò)增
        4.2.2. pMD19-T-PalA克隆載體的獲得
    4.3. pET32a-PalA表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.1. 重組表達(dá)載體pET32a-PalA的獲得
        4.3.2. 表達(dá)菌株BL21(pET32a-PalA)的獲得
    4.4. HPS-PalA生物信息學(xué)分析
        4.4.1. HPS-PalA基因編碼氨基酸序列基本理化性質(zhì)的分析
        4.4.2. HPS-PalA基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性分析
        4.4.3. 跨膜區(qū)分析
        4.4.4. PalA基因編碼蛋白質(zhì)的主要抗原域預(yù)測(cè)
        4.4.5. HPS-PalA基因編碼蛋白質(zhì)的表面可能性預(yù)測(cè)
        4.4.6. HPS-PalA基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)
        4.4.7. HPS-PalA基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        4.4.8. 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        4.4.9. 進(jìn)化樹分析
5. 討論
    5.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
    5.2. PaLA基因的PCR擴(kuò)增及克隆
    5.3. pET32a-PalA表達(dá)載體的構(gòu)建
    5.4. PaLA基因的生物信息學(xué)分析
6. 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3791441