嗜吞噬細胞無形體是經(jīng)蜱傳播的專性的革蘭氏陰性小球桿菌，還是重要的人獸共患病病原體，不僅可以感染人，也可以感染牛羊反芻動物，及馬和狗等家養(yǎng)動物。自20世紀90年代初于美國首次發(fā)現(xiàn)以來，澳洲、歐洲多國、韓國及我國先后均有報道，且近年來呈上升趨勢。由于該病的臨床多表現(xiàn)為急性不明原因發(fā)熱，肌肉痛，乏力，頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀，臨床缺乏對該病的足夠認識，也缺乏相應的快速診斷方法，因此該病及易發(fā)生誤診，嚴重時可導致多器官功能衰竭，甚至死亡，所以對該病的確診就要結(jié)合實驗室檢測進行診斷，目前應用于實驗室檢測方法主要有IFA、急性期的血液涂片檢查、巢氏PCR、直接對病原的分離培養(yǎng)。但是免疫熒光方法（IFA）不僅需要特殊儀器如熒光顯微鏡，還需要等到恢復期采集第二次血液標本。病原體分離培養(yǎng)診斷十分可靠，但分離率低且耗時。以PCR為基礎的分子生物學技術可以取代分離培養(yǎng)進行病原體檢測，但需要特殊的儀器及具備一定實驗室經(jīng)驗的人員才能完成。因此開發(fā)一種簡便的靈敏性的高特異性的檢測方法對于該病原體的診斷是很有必要的。 嗜吞噬細胞無形體的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是無形體的特征性的蛋白家族，該家族基因包...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
英文縮略詞表
第一篇 綜述
    1 病原分類學
    2 病原及基因組特點
    3 嗜吞噬細胞無形體的入侵機制
    4 傳播媒介及宿主動物
    5 流行病學
    6 臨床癥狀及治療
    7 診斷和實驗室檢測
        7.1 臨床癥狀
        7.2 直接鑒定
        7.3 PCR檢測和病原分離培養(yǎng)
        7.4 血清學診斷
        7.5 病理學診斷
    8 P44/msp2蛋白
第二篇 實驗研究
    實驗一 msp2、msp4蛋白全長中信號肽對原核表達的影響
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 序列來源及菌株
                1.1.2 主要儀器設備
            1.2 方法
                1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
                1.2.2 陽性表達菌BL21（DE3）鑒定
                1.2.3 陽性表達菌的誘導表達
            1.3 pET28a表達載體的構(gòu)建及表達菌的誘導
                1.3.1 三個重組的pET32a質(zhì)粒與pET28a（+）空載體酶切
                1.3.2 目的片段與pET-28a大片段連接
                1.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達菌BL21（DE3）
                1.3.4 pET28a陽性重組表達菌的鑒定
                1.3.5 陽性表達菌的誘導表達
            1.4 pGEX-4T-1表達載體的構(gòu)建和表達菌的誘導
            1.5 E-msp2、N-msp4、Z-msp4的信號肽分析
        2 實驗結(jié)果
            2.1 合成的三個表面蛋白全長基因的pET32a載體酶切鑒定
            2.2 重組質(zhì)粒pET32a（+）誘導表達情況
            2.3 重組質(zhì)粒pET28a（+）表達載體的酶切鑒定
            2.4 重組質(zhì)粒pET28a（+）誘導表達情況
            2.5 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1表達載體的酶切鑒定
            2.6 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1誘導表達情況
            2.7 信號肽分析結(jié)果
        3 討論
            3.1 信號肽對原核蛋白表達的影響
            3.2 跨膜區(qū)對原核蛋白表達的影響
            3.3 稀有密碼子對原核蛋白表達的影響
    實驗二 嗜吞噬細胞無形體msp2、msp4蛋白的生物信息學分析及表達純化
        摘要
        1 方法和材料
            1.1 材料
                1.1.1 菌株和試劑
                1.1.2 主要儀器設備
            1.2 實驗方法
                1.2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息學分析
                1.2.2 引物設計
                1.2.3 原核表達載體構(gòu)建
                1.2.4 蛋白的誘導表達
                1.2.5 重組蛋白的表達形式分析
                1.2.6 重組蛋白表達條件的優(yōu)化
                1.2.7 Western-blot分析
                1.2.8 重組蛋白的純化
                1.2.9 純化后的重組蛋白的濃度測定（BCA法）
        2 結(jié)果
            2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息學分析結(jié)果
                2.1.1 ProtParam工具分析結(jié)果
                2.1.2 SOPMA預測msp2、msp4蛋白的二級結(jié)構(gòu)
                2.1.3 msp2、msp4蛋白的跨膜區(qū)預測結(jié)果
                2.1.4 msp2、msp4蛋白的親水性預測結(jié)果
                2.1.5 msp2、msp4蛋白的抗原表位分析
            2.2 原核表達載體的構(gòu)建
            2.3 小量蛋白誘導表達
            2.4 重組蛋白的表達形式分析
            2.5 蛋白的誘導條件的優(yōu)化
                2.5.1 不同濃度下IPTG對蛋白表達的影響
                2.5.2 低溫條件下對蛋白的表達形式的影響
            2.6 蛋白的純化
            2.7 WesternBlot
        3 討論
    實驗三 重組msp2、msp4蛋白的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要試劑
                1.1.2 主要血清
                1.1.3 主要儀器
                1.1.4 實驗動物
                1.1.5 主要試劑的配制
            1.2 方法
                1.2.1 重組蛋白的多抗的制備
                1.2.2 小鼠抗體水平的測定-ELISA
                1.2.3 間接ELISA最佳工作條件的的確定
        2 結(jié)果
            2.1 小鼠抗體水平的測定
            2.2 ELISA工作條件的確定
                2.2.1 抗原包被的最佳濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
                2.2.2 最適封閉液的和封閉時間的確定
                2.2.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定
                2.2.5 底物作用時間的確定
                2.2.6 cut-off值的確定
                2.2.7 特異性試驗
                2.2.8 靈敏性試驗
                2.2.9 重復性試驗
                2.2.10 臨床樣品檢測
        3 討論
第三篇 實驗結(jié)論
參考文獻
附件
致謝
作者簡介及在研究生期間主要參與的研究項目、發(fā)表文章
石河子大學碩士研究生學位論文導師評閱表



本文編號：3789568