本文以CSFV蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)為研究基礎(chǔ),分別研究：各蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)情況；在細(xì)胞中各蛋白真核表達(dá)情況；在細(xì)胞中真核表達(dá)的各蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的影響；以及在細(xì)胞中真核表達(dá)的各蛋白對(duì)病毒感染的影響。 為研究豬瘟病毒蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)情況,將原核表達(dá)的各個(gè)CSFV蛋白純化后分別免疫昆明小鼠制備多克隆抗體血清。結(jié)果獲得除P7蛋白外11個(gè)重組CSFV蛋白并制備獲得高滴度抗體的免疫血清。Western-Blotting能檢測(cè)到病毒各蛋白片段與預(yù)期大小的一致,其中E0、E1、E2和NS5A還以蛋白聚合體形式存在。間接免疫熒光分析(Indirect Immuno-fluorescence Assay IFA)檢測(cè)顯示Npro主要定位于細(xì)胞核；C、E0和NS2在細(xì)胞核亦有分布,但主要是位于細(xì)胞質(zhì)中；其他蛋白則位于細(xì)胞質(zhì)中；E0蛋白還在細(xì)胞膜表面有分布。結(jié)果分析表明,分布于細(xì)胞核上的CSFV蛋白可能對(duì)細(xì)胞有調(diào)控作用,而分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白則主要參與病毒復(fù)制、組裝和增殖。 將CSFV C株各蛋白基因以pEGFP-N1為載體構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞來(lái)研究各蛋白在細(xì)胞中真核表達(dá)情況。PCR檢測(cè)結(jié)...

【文章頁(yè)數(shù)】：115 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 CSFV分子生物學(xué)特性
    2 CSFV感染宿主細(xì)胞的途徑和機(jī)制
    3 CSFV感染免疫抑制機(jī)理
    4 CSFV感染致組織病變及機(jī)理
    5 CSFV在感染細(xì)胞中復(fù)制增殖機(jī)制
    6 結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV感染中的作用
    7 非結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV感染細(xì)胞中的作用
    8 展望及本研究目的
第二章 CSFV蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)情況的研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 CSFV蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.2 CSFV蛋白原核表達(dá)與鑒定
            1.2.3 蛋白純化
            1.2.4 多克隆抗體制備
            1.2.5 Western blotting檢測(cè)CSFV感染細(xì)胞中病毒蛋白
            1.2.6 IFA鑒定CSFV感染細(xì)胞中病毒蛋白
    2 結(jié)果
        2.1 CSFV蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 CSFV蛋白原核表達(dá)、鑒定及純化
        2.3 ELISA檢測(cè)CSFV蛋白免疫小鼠血清抗體
        2.4 Western blotting檢測(cè)CSFV感染細(xì)胞中病毒蛋白
        2.5 IFA鑒定CSFV感染細(xì)胞中病毒蛋白
    3 分析與討論
    4 小結(jié)
第三章 CSFV蛋白真核表達(dá)研究及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、病毒和ST細(xì)胞
            1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 CSFV蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選
            1.2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)
            1.2.4 細(xì)胞克隆及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立
            1.2.5 細(xì)胞系穩(wěn)定性及細(xì)胞增殖情況測(cè)定
            1.2.6 細(xì)胞周期測(cè)定
    2 結(jié)果
        2.1 CSFV蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選
        2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白基因檢測(cè)
        2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光觀察
            2.4.1 熒光信號(hào)強(qiáng)弱
            2.4.2 熒光信號(hào)分布
        2.5 細(xì)胞克隆及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的鑒定
        2.6 細(xì)胞系穩(wěn)定性及增殖情況測(cè)定
        2.7 細(xì)胞周期測(cè)定
    3 分析與討論
    4 小結(jié)
第四章 各CSFV蛋白真核表達(dá)后對(duì)病毒感染影響的研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞和病毒
            1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            1.2.2 pMD-Actin質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 檢測(cè)CSFV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立
            1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CSFV蛋白細(xì)胞系中病毒滴度
    2 結(jié)果
        2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和提取
        2.2 檢測(cè)CSFV熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法建立
            2.2.1 檢測(cè)CSFV基因和β-Actin基因的競(jìng)爭(zhēng)曲線
            2.2.2 直線回歸方程的建立
        2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CSFV蛋白細(xì)胞系中病毒滴度
    3討論分析
    4 小結(jié)
第五章 EO分泌及其在CSFV釋放中的作用研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞和病毒
            1.1.2 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光蛋白定位分析
            1.2.2 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中融合蛋白
            1.2.3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中融合蛋白
            1.2.4 CSFV感染蛋白細(xì)胞系中病毒滴度的檢測(cè)
            1.2.5 CSFV感染細(xì)胞培養(yǎng)基中病毒分布情況
    2 結(jié)果
        2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光蛋白定位分析
        2.2 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中融合蛋白
        2.3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中融合蛋白
        2.4 CSFV感染蛋白細(xì)胞系中病毒滴度的檢測(cè)
        2.5 CSFV感染細(xì)胞培養(yǎng)基中病毒粒子分析
    3 討論分析
    4 小結(jié)
全文總結(jié)及論文創(chuàng)新之處
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞中英文對(duì)照表
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3779704