Myostatin,肌肉生長抑制素,是肌肉生長發(fā)育的抑制因子。本研究針對Myostatin前肽和成熟肽分別制備拮抗劑與疫苗,從細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平驗(yàn)證這兩種生物制劑對綿羊骨骼肌發(fā)育的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.綿羊Myostatin前肽對成肌細(xì)胞分化的作用。構(gòu)建和包裝Myostatin前肽過表達(dá)慢病毒載體,制備慢病毒,分別用慢病毒感染C2C12細(xì)胞,檢測Myostatin前肽對C2C12細(xì)胞分化的影響。結(jié)果對照組和試驗(yàn)組肌管融合率分別為5.62%和9.38%,試驗(yàn)組的肌管融合率顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明Myostatin前肽基因的過表達(dá)可能抑制了Myostatin,從而促進(jìn)了肌管的形成。2.Myostatin前肽蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏嗜性及Myostatin前肽蛋白特定位點(diǎn)突變后生物學(xué)活性增強(qiáng)的特性,完成對羊Myostatin前肽基因序列的密碼子優(yōu)化,并將第76位的天冬氨酸(Asp)突變成丙氨酸(Ala)。將修飾后的Myostatin前肽基因克隆至酵母表達(dá)載體pPIC9K,構(gòu)建酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-Msp。用電轉(zhuǎn)化把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢...

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 緒論
    1 研究目的與意義
    2 國內(nèi)外研究進(jìn)展
        2.1 Myostatin基因研究進(jìn)展
            2.1.1 Myostatin的發(fā)現(xiàn)與研究進(jìn)展
            2.1.2 Myostatin基因的分子結(jié)構(gòu)及同源性
            2.1.3 Myostatin蛋白的合成及生物學(xué)特性
            2.1.4 Myostatin的信號通路
            2.1.5 Myostatin基因的生物學(xué)功能
            2.1.6 Myostatin拮抗劑的研究進(jìn)展
            2.1.7 Myostatin抗體的研究進(jìn)展
        2.2 疫苗研究進(jìn)展
            2.2.1 傳統(tǒng)疫苗
            2.2.2 核酸疫苗
            2.2.3 核酸疫苗的免疫機(jī)理
            2.2.4 乙肝表面抗原增強(qiáng)免疫原性的研究
    3 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
第二章 試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一 綿羊Myostatin前肽對成肌細(xì)胞的分化作用
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            1.2 慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
            1.3 實(shí)驗(yàn)方法
                1.3.1 Myostatin前肽過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及制備
                1.3.2 包裝細(xì)胞株293T細(xì)胞的培養(yǎng)
                1.3.3 Myostatin前肽過表達(dá)慢病毒的包裝
                1.3.4 滴度檢測
                1.3.5 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
                1.3.6 成肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)及其指標(biāo)測定
                1.3.7 Westernblot檢測蛋白表達(dá)
        2 結(jié)果
            2.1 Myostatin前肽克隆
            2.2 Myostatin前肽過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定
            2.3 WB檢測結(jié)果
            2.4 滴度結(jié)果
            2.5 過表達(dá)Myostatin前肽對成肌細(xì)胞的分化
                2.5.1 免疫熒光檢測結(jié)果
                2.5.2 肌管融合率的測定
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)二 Myostatin前肽蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 菌株和質(zhì)粒
                1.1.2 工具酶和生化試劑
                1.1.3 培養(yǎng)基
            1.2 方法
                1.2.1 Myostatin前肽蛋白密碼子優(yōu)化及突變
                1.2.2 pPIC9K-Msp重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.3 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115
                1.2.4 壓力篩選
                1.2.5 重組酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)
                1.2.6 WesternBlot鑒定Myostatin前肽的表達(dá)
        2 結(jié)果
            2.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-Msp的構(gòu)建及酶切鑒定
            2.2 壓力篩選
            2.3 重組質(zhì)粒pPIC9K-Msp的PCR鑒定
            2.4 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE和Westernblot鑒定
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)三 Myostatin前肽蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 菌株和質(zhì)粒
                1.1.2 工具酶和生化試劑
            1.2 方法
                1.2.1 引物的設(shè)計(jì)
                1.2.2 PCR擴(kuò)增
                1.2.3 PCR產(chǎn)物膠回收
                1.2.4 克隆載體pMD18-M的構(gòu)建
                1.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                1.2.6 目的蛋白表達(dá)
                1.2.7 目的蛋白的純化
        2 結(jié)果
            2.1 質(zhì)粒構(gòu)建
            2.2 綿羊突變型Myostatin前肽蛋白序列的擴(kuò)增
            2.3 蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分析
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)四 Myostatin前肽蛋白對羔羊肌肉生長的影響
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇
            1.2 試驗(yàn)時(shí)間地點(diǎn)
            1.3 實(shí)驗(yàn)方法
                1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
                1.3.2 屠宰實(shí)驗(yàn)
                1.3.3 測定指標(biāo)
                1.3.4 采集樣品
                1.3.5 HE染色切片制作程序
                1.3.6 熒光定量PCR
                1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 注射Myostatin前肽重組蛋白對羔羊肌肉生長的作用
            2.2 利用Myostatin前肽重組蛋白動(dòng)物模型,研究肌肉纖維增大的生理和分子機(jī)制
            2.3 注射Myostatin前肽后對Myostatin信號通路下游及相關(guān)基因的影響
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)五 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制備及對小鼠肌肉生長的影響
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
                1.1.1 菌株和質(zhì)粒
                1.1.2 工具酶和生化試劑
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取
                1.2.2 核酸疫苗pV-SM的構(gòu)建
                1.2.3 質(zhì)粒的大量培養(yǎng)及抽提純化
                1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇
                1.2.5 免疫方法
                1.2.6 樣品采集
                1.2.7 組織切片
                1.2.8 熒光定量PCR
                1.2.9 抗體檢測
                1.2.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制備
            2.2 免疫M(jìn)yostatin成熟肽核酸疫苗后對實(shí)驗(yàn)小鼠體重的影響
            2.3 免疫M(jìn)yostatin成熟肽核酸疫苗后對實(shí)驗(yàn)小鼠肌纖維的影響
            2.4 免疫小鼠抗血清的檢測
            2.5 免疫M(jìn)yostatin成熟肽核酸疫苗后對小鼠Myostatin信號通路下游相關(guān)基因影響
        3 討論
            3.1 對BALB/c小鼠肌肉生長的影響
            3.2 Myostatin成熟肽核酸疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)制
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)六 Myostatin成熟肽核酸疫苗對羔羊肌肉生長的影響
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇
                1.2.2 免疫方法
                1.2.3 屠宰實(shí)驗(yàn)
                1.2.4 測定指標(biāo)
                1.2.5 采集樣品
                1.2.6 組織切片
                1.2.7 熒光定量PCR
                1.2.8 抗體檢測
                1.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 免疫M(jìn)yostatin成熟肽核酸疫苗后對實(shí)驗(yàn)羔羊體重的影響
            2.2 免疫M(jìn)yostatin核酸疫苗后對實(shí)驗(yàn)羔羊肌纖維的影響
            2.3 免疫羔羊抗血清的檢測
            2.4 免疫M(jìn)yostatin成熟肽核酸疫苗后對羔羊Myostatin信號通路下游相關(guān)基因影響
        3 討論
            3.1 載體的選擇
            3.2 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇
            3.3 對羔羊肌肉生長的影響
        4 小結(jié)
第三章 結(jié)論
第四章 論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄1 主要儀器設(shè)備
附錄2 溶液及培養(yǎng)基配置
作者簡介
致謝
石河子大學(xué)博士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評閱表



本文編號：3739121