隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,體細胞克隆作為一種技術(shù)手段已經(jīng)被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因動物、物種保護、家畜繁育、異種器官移植以及疾病模型的研究,但是克隆效率低下一直阻礙這一技術(shù)發(fā)展。一般認為克隆效率低下與重構(gòu)胚不正確或者不完全的重組而導致的錯誤表觀修飾相關,其中最主要的就是DNA甲基化異常和組蛋白修飾錯誤。因此如何提高克隆效率對推動這一技術(shù)發(fā)展有著重要的意義。 1.徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化 為提高徒手克隆效率,我們在徒手克隆過程中對克隆胚重構(gòu)以及胚胎移植都進行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的囊胚率能達到40%左右,并將235枚桑椹胚及囊胚移植到3頭自然發(fā)情后4到5天的受體母豬子宮角內(nèi),并使兩頭受體母豬成功懷孕,雖然1頭母豬中途不幸流產(chǎn),但另1頭母豬在妊娠后第114天自然分娩產(chǎn)下8只小豬,相對與其他實驗室的克隆產(chǎn)子率明顯提高。 2.卵母細胞成熟過程及孤雌激活后胚胎發(fā)育中Tet1的免疫熒光染色 實驗選取成熟0h（GV）、12h、24h、36h和MⅡ時期脫完卵丘的卵母細胞以及孤雌激活（物理+化學）后7.5h、12h、15h、24h和2-cell（36h）胚胎用PFA固定后進行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)... 

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表(ABBREVIATION)
第一章 文獻綜述
    綜述1、影響體細胞核移植效率的因素
        1.1 卵巢及其來源
            1.1.1 卵巢受來源母豬品種、年齡影響
            1.1.2 季節(jié)變化與卵巢
            1.1.3 卵巢受采集時間和溫度影響
        1.2 供體細胞
        1.3 徒手克隆的流程與注意事項
        1.4 受體母豬與胚胎移植
        參考文獻
    綜述2 5-aza-CdR在體細胞核移植中的應用及甲基化相關基因的研究
        2.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基本作用與特征
        2.2 5-aza-CdR對胚胎發(fā)育的影響
        2.3 Tet蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能
        2.4 Tet蛋白家族的生物學作用
        2.5 Dnmts與Tet蛋白家族關系
        參考文獻
第二章 實驗研究
    第一節(jié) 徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
                1.1.1 儀器
                1.1.2 主要耗材
                1.1.3 溶液配制
                1.1.4 供體細胞
            1.2 試驗方法
                1.2.1 卵巢的采集及處理
                1.2.2 卵母細胞體外成熟
                1.2.3 徒手克隆前準備
                1.2.4 脫卵丘
                1.2.5 供體細胞準備
                1.2.6 徒手體細胞核移植技術(shù)
                1.2.7 胚胎移植
                1.2.8 妊娠診斷
        2 結(jié)果
            2.1 克隆胚胎的生產(chǎn)
            2.2 豬克隆胚胎移植
            2.3 妊娠診斷結(jié)果
            2.4 懷孕母豬的分娩
        3 分析與討論
            3.1 胚胎構(gòu)建及其胚胎發(fā)育
            3.2 關于胚胎移植
            3.3 關于徒手克隆操作
        參考文獻
    第二節(jié) Tet1在早期胚胎發(fā)育中的變化
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實驗材料
                1.1.2 試劑
                1.1.3 儀器
                1.1.4 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 卵巢的采集同第一節(jié)
                1.2.2 卵母細胞體外成熟同第一節(jié)
                1.2.3 卵母細胞的處理
                1.2.4 冷凍細胞的復蘇及培養(yǎng)
                1.2.5 胎兒成纖維細胞的處理
                1.2.6 細胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
                1.2.7 引物設計與合成
                1.2.8 熒光實時定量PCR檢測
                1.2.9 統(tǒng)計分析
                1.2.10 卵母細胞孤雌激活
                1.2.11 間接免疫熒光染色技術(shù)
        2 結(jié)果
            2.1 卵母細胞成熟及PA早期發(fā)育過程中不同時期Tet1的間接免疫熒光染色
            2.2 5-aza-CdR處理對卵母細胞成熟過程中甲基化相關基因表達的影響
            2.3 5-aza-CdR處理對豬胎兒成纖維細胞甲基化相關基因的表達影響
        3 分析與討論
            3.1 Tet1在卵母細胞成熟過程中及PA后胚胎早期發(fā)育過程中的探索
            3.2 5-aza-CdR與Dnmts相關基因的的探討
            3.3 5-aza-CdR與Tet蛋白家族相關基因的的探討
        參考文獻
全文結(jié)論
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3690902