新城疫（Newcastle disease,ND）是一種由副粘病毒科新城疫病毒（Newcastle diseas virus,NDV）引起的禽類致死性傳染病,該病具有發(fā)病急、死亡率高等特點,嚴重危害了我國養(yǎng)禽業(yè)。F蛋白是NDV的主要保護性抗原之一,可以誘導機體產(chǎn)生中和性抗體,并在機體免疫中發(fā)揮重要作用;而HN蛋白是NDV的另一保護性抗原,同樣可以對機體起到一定的保護作用。然而在不同表達系統(tǒng)中,F與HN蛋白對機體的免疫保護率卻不盡相同。因此,選擇合適的抗原基因來對機體進行免疫顯得至關重要。本研究以新城疫病毒Lasota株的F及HN為目的基因,將二者分別插入帶有CMV啟動子及VSV-GED、WPRE、ITRs等不同調控元件的假型化桿狀病毒與未經(jīng)改造的桿狀病毒基因轉移載體中,通過Bac-to-Bac表達系統(tǒng)獲得重組Bacmid DNA,將其轉染Sf9昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒;利用高滴度重組桿狀病毒侵染雞胚成纖維細胞,通過SDS-PAGE和Western blotting比較不同抗原基因在禽類細胞中的表達水平;同時利用獲得的重組桿狀病毒直接作為疫苗進行免疫,比較分析帶有不同調控元件及不同抗原... 

【文章頁數(shù)】：116 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號與縮略語
第1章 緒論
    1.1 新城疫病毒的研究進展
        1.1.1 ND的流行
        1.1.2 NDV的生物學性狀
        1.1.3 NDV基因組結構特征
        1.1.4 NDV基因編碼的主要蛋白及其功能
        1.1.5 ND的防制
    1.2 新城疫基因工程疫苗研究進展
        1.2.1 核酸疫苗
        1.2.2 亞單位疫苗
        1.2.3 活載體疫苗
        1.2.4 以NDV為活載體構建多價疫苗
    1.3 桿狀病毒表達載體系統(tǒng)概述
        1.3.1 桿狀病毒的生物學特征
        1.3.2 桿狀病毒表達系統(tǒng)及其優(yōu)缺點
    1.4 桿狀病毒作為疫苗載體的應用
        1.4.1 桿狀病毒作為哺乳動物疫苗載體的應用
        1.4.2 桿狀病毒作為禽類疫苗載體的應用
        1.4.3 桿狀病毒雙表達系統(tǒng)在疫苗載體中的應用
    1.5 本研究的目的和意義
    1.6 本研究的實驗技術路線
        1.6.1 重組桿狀病毒轉移載體的構建策略
        1.6.2 重組桿狀病毒的擴增和外源基因的表達
        1.6.3 重組桿狀病毒免疫效果的研究
    1.7 課題資助名稱
第2章 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 供試菌種和質粒
        2.1.3 擴增引物
        2.1.4 主要儀器設備
        2.1.5 主要分子生物學及生化試劑
        2.1.6 主要緩沖液及試劑配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 重組轉移載體的構建
        2.2.2 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid DNA的獲得
        2.2.3 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid DNA轉染Sf9昆蟲細胞
        2.2.4 重組桿狀病毒的擴增及滴度測定
        2.2.5 重組桿狀病毒在雞胚成纖維細胞中表達
        2.2.6 重組蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting檢測
        2.2.7 VSV-GED蛋白的間接免疫熒光檢測
        2.2.8 重組桿狀病毒的雞體免疫試驗
第3章 結果
    3.1 重組轉移載體的構建
        3.1.1 重組轉移載體pLM-F系列的構建
        3.1.2 重組轉移載體pLM-HN系列的構建
    3.2 重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定
        3.2.1 重組穿梭轉移載體Bacmid F系列的鑒定
        3.2.2 重組穿梭轉移載體Bacmid HN系列的鑒定
    3.3 重組桿狀病毒穿梭載體轉染Sf9昆蟲細胞
        3.3.1 Sf9昆蟲細胞生長曲線的繪制
        3.3.2 Sf9昆蟲細胞正常及病變形態(tài)比較
    3.4 重組桿狀病毒的擴增及滴度測定
        3.4.1 重組桿狀病毒滴度測定
        3.4.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定
    3.5 重組桿狀病毒介導目的基因在雞胚成纖維細胞中的表達及分析
        3.5.1 雞胚成纖維細胞的形態(tài)
        3.5.2 重組蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鑒定
        3.5.3 重組蛋白的Western blotting分析
    3.6 VSV-GED蛋白的間接免疫熒光檢測
    3.7 動物免疫—攻毒試驗
        3.7.1 免疫和攻毒后各試驗組的臨床癥狀及免疫保護率
        3.7.2 病理學觀察
        3.7.3 F48E9強毒株TCID_(50)的測定
        3.7.4 免疫雞血清中和抗體效價的測定
        3.7.5 免疫雞血清IgG抗體檢測
        3.7.6 免疫雞淋巴細胞增殖試驗
        3.7.7 免疫雞血清細胞因子檢測
第4章 討論
    4.1 課題背景
    4.2 編碼的抗原基因對重組桿狀病毒疫苗免疫原性的影響
    4.3 載體對重組桿狀病毒疫苗免疫原性的影響
        4.3.1 WPRE和VSV-GED元件對外源基因表達效率的影響
        4.3.2 ITRs對外源基因表達的影響
    4.4 免疫劑量和免疫程序的選擇
第5章 結論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況



本文編號：3679333