本文關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型噬菌體裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬鏈球菌2型(Streptococcus.suis 2,S.suis 2)是重要的人獸共患病原菌,臨床分離株普遍耐藥,傳統(tǒng)的抗生素療法面臨挑戰(zhàn),基于噬菌體裂解酶的抗菌策略再現(xiàn)潛力。噬菌體裂解細(xì)菌依賴于侵染后期合成的裂解酶,可特異高效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁。噬菌體SMP是迄今為止國(guó)內(nèi)外分離到的唯一的一株S.suis 2烈性噬菌體,其編碼的裂解酶LyACCG(又叫LySMP)由N-端一個(gè)amidase-5(A5)催化域、中間兩個(gè)Cpl-7(C7)結(jié)合域及C-端一個(gè)glucosaminidase(G)催化域組成,為了鑒定LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),本研究:(一)LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域鑒定。(1)原核表達(dá)LyACCG的各結(jié)構(gòu)域片段。以噬菌體SMP基因組為模板,分別PCR擴(kuò)增編碼LyA、LyAC、LyACC、LyG、LyCG、LyCCG和LyACCG(依次對(duì)應(yīng)于LyACCG的第1-145、1-195、1-240、300-410、195-410、150-410和1-481位氨基酸)的基因片段,重組于pSJ2質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表明,各結(jié)構(gòu)域片段均為胞內(nèi)可溶性表達(dá),其分子質(zhì)量依次約為19 ku、25 ku、30 ku、16 ku、28 ku、32 ku和56 ku,符合預(yù)期大小。(2)定性分析各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性。大量培養(yǎng)收集各轉(zhuǎn)化菌,超聲破壁,離心取上清過(guò)濾,獲蛋白粗提液,平板裂解試驗(yàn)檢測(cè)顯示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG(均含催化域A5)對(duì)S.suis 2強(qiáng)毒株HA9801的裂菌圈直徑依次為1.2 cm、1.7 cm、2.2 cm和1.3 cm,而LyG、LyCG和LyCCG(均含催化域G,不含催化域A5)均無(wú)裂菌活性,說(shuō)明LyACCG的裂菌活性來(lái)自于催化域A5,催化域G無(wú)裂菌活性;LyA、LyAC、LyACC和LyACCG均可殺滅豬鏈球菌2型(12株)和7型,對(duì)豬鏈球菌9型、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌(5株)、巴氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌均無(wú)裂解作用,LyA的裂菌譜和LyACCG相同,表明LyACCG作用的細(xì)菌種屬特異性源自催化域A5,與結(jié)合域C7和催化域G無(wú)關(guān)。(3)定量比較LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌活性。鎳離子親和層析純化LyA、LyAC、LyACC和LyACCG,以30 min內(nèi)能夠使108 cfu/mL的HA9801濁度下降一半的酶濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)(酶活單位/Unit),結(jié)果顯示,LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度依次為8.17μmol/mL、3.29μmol/m L、0.28μmol/m L和1.85μmol/mL;LyACCG的濃度是LyACC的7倍,說(shuō)明催化域G對(duì)酶活性具有抑制作用;LyA和LyAC的濃度分別是LyACC的29和12倍,說(shuō)明結(jié)合域C7對(duì)催化域A5的活性有促進(jìn)作用,但不是決定作用。2μmol/m L的LyACC和LyACCG分別可使生物被膜內(nèi)的HA9801的細(xì)菌密度下降44.23%和14.44%,再證催化域G的存在抑制了酶活性。(4)LyACC裂菌活性的影響因素分析。LyACC的最適反應(yīng)pH=8.0,Fe2+和Mg2+對(duì)其裂菌活性沒(méi)有影響,Zn2+、Cu2+和高濃度的Ca2+會(huì)抑制其裂菌活性。(二)催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)鑒定。(1)催化域A5中各氨基酸位點(diǎn)的保守性分析。用NCBI、Uniport和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù),比對(duì)分析并計(jì)算催化域A5中各氨基酸位點(diǎn)的保守性,選擇11個(gè)高度保守的氨基酸位點(diǎn)(Y18、D30、C31、S32、G43、T53、G85、G92、G95、H96和I107)和3個(gè)保守性較低的氨基酸位點(diǎn)(E70、D73或D75)待突變。(2)高保守性氨基酸位點(diǎn)的突變。以質(zhì)粒pSJ2-lyacc為模板,將11個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)的密碼子分別定點(diǎn)突變?yōu)楸彼?A),突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達(dá)的各突變依次命名為Y18A、D30A、C31A、S32A、G43A、T53A、G85A、G92A、G95A、H96A和I107A,SDS-PAGE分析表明,各突變體均為胞內(nèi)可溶性表達(dá),分子質(zhì)量均約為30 ku,符合預(yù)期大小。(3)低保守性氨基酸位點(diǎn)的突變。以質(zhì)粒pSJ2-lyacc為模板,將3個(gè)低保守的氨基酸位點(diǎn)同時(shí)定點(diǎn)突變?yōu)榫彼?構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,1 mmol/L IPTG 27°C誘導(dǎo)表達(dá)的突變體命名為L(zhǎng)y7X,SDSPAGE分析表明,突變體Ly7X為胞內(nèi)可溶性表達(dá),其分子質(zhì)量約為30 ku,符合預(yù)期大小。(4)各突變體的裂菌活性分析。各突變體的蛋白粗提液經(jīng)平板裂解試驗(yàn)檢測(cè)顯示,突變體D30A、C31A、S32A、G43A、T53A和H96A的裂菌圈消失,徹底失去裂菌活性,說(shuō)明D30、C31、S32、G43、T53和H96是LyACC的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn);突變體Y18A、G85A、G92A、G95A和I107A的裂菌圈直徑較LyACC依次減小了0.9 cm、0.8 cm、0.3 cm、0.5 cm和0.3cm,說(shuō)明Y18、G85、G92、G95和I107對(duì)LyACC的裂菌活性有重要作用;突變體Ly7X的裂菌圈直徑較LyACC減小了0.8 cm,說(shuō)明保守性較低的E70、D73和D75對(duì)LyACC的裂菌活性也有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：豬鏈球菌 噬菌體 裂解酶 分段表達(dá) 裂菌活性 關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.611
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 縮略語(yǔ)表8-11
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述11-23
• 1 豬鏈球菌11-14
• 1.1 概述11
• 1.2 流行病學(xué)11-12
• 1.3 豬鏈球菌的致病機(jī)制12-13
• 1.4 豬鏈球菌耐藥性的研究13-14
• 2 噬菌體14-18
• 2.1 噬菌體概述14-15
• 2.2 噬菌體療法15-16
• 2.3 豬鏈球菌噬菌體16-18
• 3 裂解酶18-22
• 3.1 裂解酶概述18-19
• 3.2 裂解酶的結(jié)構(gòu)組成19-20
• 3.3 細(xì)菌對(duì)裂解酶的耐藥性20-21
• 3.4 裂解酶的應(yīng)用21-22
• 4 展望22-23
• 第二篇 試驗(yàn)部分23-56
• 第一章 LyACCG的結(jié)構(gòu)域片段表達(dá)23-33
• 1 材料方法23-29
• 1.1 試驗(yàn)菌株和主要試劑23-24
• 1.2 LyACCG結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)24
• 1.3 PCR擴(kuò)增24-25
• 1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建25-26
• 1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞26-27
• 1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞27
• 1.7 各結(jié)構(gòu)域片段的原核表達(dá)27-28
• 1.8 SDS-PAGE分析原核表達(dá)的各結(jié)構(gòu)域片段28-29
• 2 結(jié)果29-31
• 2.1 LyACCG的結(jié)構(gòu)域組成29
• 2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果29-30
• 2.3 PCR鑒定及測(cè)序分析30
• 2.4 各結(jié)構(gòu)域片段的原核表達(dá)30-31
• 3 結(jié)論31-33
• 第二章 裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域鑒定33-48
• 1 材料方法33-38
• 1.1 試驗(yàn)菌株和主要試劑33-34
• 1.2 各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性檢測(cè)34
• 1.3 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG裂菌譜的測(cè)定34
• 1.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的鎳柱純化34-35
• 1.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度測(cè)定35
• 1.6 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活單位測(cè)定35-36
• 1.7 LyACC和LyACCG生物被膜清除能力測(cè)定36
• 1.8 LyACC的離子純化36
• 1.9 LyACC的酶活單位測(cè)定36-37
• 1.10 LyACC最適反應(yīng)pH的測(cè)定37
• 1.11 還原劑對(duì)LyACC裂菌活性的影響37
• 1.12 金屬離子對(duì)LyACC裂菌活性的影響37-38
• 2 結(jié)果38-45
• 2.1 各結(jié)構(gòu)域片段的裂菌活性38
• 2.2 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的裂菌譜38-40
• 2.3 鎳柱純化的LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的SDS-PAGE分析40
• 2.4 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的濃度40
• 2.5 LyA、LyAC、LyACC和LyACCG的酶活單位40-41
• 2.6 LyACC和LyACCG清除HA9801生物被膜的效率41-42
• 2.7 SDS-PAGE分析離子純化的LyACC42
• 2.8 LyACC的酶活單位42
• 2.9 LyACC的最適反應(yīng)pH42-43
• 2.10 還原劑對(duì)LyACC裂菌活性的影響43
• 2.11 金屬離子對(duì)LyACC裂菌活性的影響43-45
• 3 討論45-48
• 第三章 催化域A5的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)鑒定48-56
• 1 材料與方法48-51
• 1.1 試驗(yàn)菌株和主要試劑48
• 1.2 催化域A5中各氨基酸位點(diǎn)的保守性分析48
• 1.3 催化域A5中保守氨基酸位點(diǎn)的選擇與突變48-50
• 1.4 催化域A5中保守性較低的酸性氨基酸位點(diǎn)的篩選與突變50-51
• 1.5 LyACC及其突變體的原核表達(dá)51
• 1.6 LyACC及其突變體的裂菌活性檢測(cè)51
• 2 結(jié)果51-54
• 2.1 催化域A5中保守氨基酸位點(diǎn)的選擇及突變結(jié)果51-52
• 2.2 催化域A5中保守性較低的酸性氨基酸位點(diǎn)的選擇及突變結(jié)果52-53
• 2.3 LyACC及其突變體的裂菌活性53-54
• 3 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 附錄 試劑配制65-67
• 致謝67-68
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介68-70
• 作者簡(jiǎn)介70-71

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2 唐文淵 ,Zygmunt Pejsak;豬鏈球菌是一種條件性病原菌[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2005年04期

3 查紅波;2型豬鏈球菌研究進(jìn)展[J];江西飼料;2005年04期

4 許青華;重新認(rèn)識(shí)豬鏈球菌[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2005年09期

5 劉華;喻華;周忠華;顏英俊;黃文方;;致生豬疫情的豬鏈球菌檢測(cè)結(jié)果分析[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

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7 白昀;覃倫;龍劍明;熊毅;覃芳蕓;朱偉;郭建剛;李華明;劉棋;;豬鏈球菌9型的分離與鑒定[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2007年01期

8 王福貴;龍忠臣;王海鵬;;臨床分離豬鏈球菌的藥物敏感性分析[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2007年06期

9 覃芳蕓;陳磊;潘杰;熊毅;白昀;朱偉;郭建剛;李華明;劉棋;;豬鏈球菌1型的分離與鑒定[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2007年09期

10 魯杏華;談志祥;何世成;劉道新;邱立新;范仲鑫;唐小明;鄭姣妹;;豬鏈球菌2型湖南株的分離與鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2008年10期

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1 記者 曾星;快速豬鏈球菌檢測(cè)方法問(wèn)世[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2005年

2 記者 姚雷 張穎;豬鏈球菌檢測(cè)將有據(jù)可依[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2005年

3 雒慶舉;可能對(duì)“豬鏈球菌”設(shè)險(xiǎn)嗎[N];中國(guó)保險(xiǎn)報(bào);2005年

4 井 韋;把四天縮短為四小時(shí)[N];中國(guó)質(zhì)量報(bào);2005年

5 菊　文;積極應(yīng)對(duì)豬鏈球菌2型疫情[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2005年

6 記者 何成軍 見(jiàn)習(xí)記者 錢河山;豬鏈球菌疫情不足憂[N];甘肅經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào);2005年

7 鄭靈巧;豬鏈球菌進(jìn)犯人類告訴我們什么[N];健康報(bào);2005年

8 北京地壇醫(yī)院主任醫(yī)師 蔡皓東;豬鏈球菌又到人間作孽[N];健康報(bào);2005年

9 記者 原國(guó)鋒;豬鏈球菌快速檢測(cè)方法通過(guò)鑒定[N];人民日?qǐng)?bào);2005年

10 逸聞;豬鏈球菌序列變異導(dǎo)致毒力增加[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2006年

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1 姚新月;2型豬鏈球菌無(wú)毒株的分離鑒定與比較基因組學(xué)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 潘子豪;致仔豬腦膜炎新型豬鏈球菌的鑒定[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 魏子貢;豬鏈球菌流行病學(xué)及其生物被膜形成機(jī)理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 李學(xué)瑞;豬鏈球菌防治新技術(shù)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

5 吳全忠;豬鏈球菌2型在模型動(dòng)物豚鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布及基因免疫[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

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6 劉金;豬樹(shù)突狀細(xì)胞在豬鏈球菌2型感染致炎癥風(fēng)暴中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 劉建濤;豬鏈球菌2型分支酸合成酶促炎機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 龔秀芳;2型豬鏈球菌N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代謝通路中SSU0448基因功能的初步研究[D];南京師范大學(xué);2015年

9 陶醉;豬鏈球菌2型(p)ppGpp合成酶與核糖體相互作用的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 劉希健;豬鏈球菌2型轉(zhuǎn)錄因子SloR調(diào)控功能的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型噬菌體裂解酶LyACCG的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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