豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一種急性、高度傳播性的腸道疾病,該病由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起,以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水等為主要臨床特征。PED于2010年起在中國再次爆發(fā),該次流行主要以變異毒株的出現(xiàn)為特征,造成80%-100%的哺乳仔豬發(fā)病,50%-90%的仔豬死亡。后來該病于2013年5月在美國爆發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的重要病原,給當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失,其靶細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和樹突狀細(xì)胞,其感染后主要的臨床組織病變?yōu)榱馨图?xì)胞減少和炎性細(xì)胞浸潤,最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能抑制,從而繼發(fā)感染其他細(xì)菌和病毒。本論文針對這兩種豬的重要病原,主要研究內(nèi)容如下：1.PEDV的流行病學(xué)調(diào)查通過對2011年2月至2011年10月間從華中、華東、華南、西南地區(qū)12個(gè)省份的57個(gè)豬場采的455份臨床樣品（包括糞便樣品、小腸樣品和乳汁樣品）,用RT-P... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：169 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表(ABBREVIATION)
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展
        1.1.1 PED的流行
        1.1.2 PEDV的分類地位
        1.1.3 PEDV的分子結(jié)構(gòu)
        1.1.4 5'UTR和3’UTR
        1.1.5 復(fù)制酶基因ORF1
        1.1.6 S基因的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用
        1.1.7 M基因的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.8 E基因的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.9 ORF3基因的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.10 N基因的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.11 PEDV的受體研究進(jìn)展
    1.2 冠狀病毒感染性克隆研究進(jìn)展
    1.3 豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展
        1.3.1 豬圓環(huán)病毒概述
        1.3.2 PCV2生物學(xué)特性
        1.3.3 PCV2基因組成
        1.3.4 PCV2編碼的蛋白質(zhì)
        1.3.5 PCV2病毒的復(fù)制
        1.3.6 PCV2的傳播途徑
        1.3.7 PCV2感染與臨床疾病
        1.3.8 PCV2致病機(jī)理
        1.3.9 PCV2與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用
第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的構(gòu)建
    2.1 研究的目的及意義
    2.2 材料與方法
        2.2.1 病料
        2.2.2 細(xì)胞與菌株
        2.2.3 載體與質(zhì)粒
        2.2.4 工具酶及主要試劑
        2.2.5 重要儀器和設(shè)備
        2.2.6 培養(yǎng)基配制
        2.2.7 感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.8 分子生物學(xué)分析軟件
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 病料采集與處理
        2.3.2 病毒的分離
        2.3.3 PEDV的增殖
        2.3.4 TCID_(50)的測定
        2.3.5 病毒RNA提取
        2.3.6 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.3.7 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.3.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.3.9 間接免疫熒光(IFA)
        2.3.10 RNA定向重組
        2.3.1 1病毒空斑純化
        2.3.12 病毒生長曲線的繪制
        2.3.13 重組病毒對胰蛋白酶依賴性測定
        2.3.14 MLV系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系Vero-hTMPRSS2-HA篩選
        2.3.15 hTMPRSS2在重組病毒感染過程中的作用
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.4.1 豬流行性腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查
        2.4.2 病毒的分離
        2.4.3 PEDV CHGDU株病毒毒價(jià)的測定
        2.4.4 病毒的RT-PCR檢測
        2.4.5 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)
        2.4.6 病毒的S基因全長序列測定及分析
        2.4.7 病毒的S基因全長克隆及IFA驗(yàn)證
        2.4.8 穿梭質(zhì)粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP的構(gòu)建
        2.4.9 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
        2.4.10 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP生長曲線的繪制
        2.4.11 rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP對胰蛋白酶依賴性測定
        2.4.12 穩(wěn)定表達(dá)蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81細(xì)胞系的構(gòu)建
        2.4.13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用測定
    2.5 討論
        2.5.1 PEDV流行病學(xué)調(diào)查及CHGDU毒株的分離鑒定
        2.5.2 PEDV CHGDU株S基因全長測序及序列分析
        2.5.3 重組病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
    2.6 小結(jié)
第3章 豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    3.1 研究目的及意義
    3.2 材料與方法
        3.2.1 毒株及細(xì)胞
        3.2.2 培養(yǎng)基與相關(guān)試劑的配制
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 主要儀器
        3.2.5 試驗(yàn)動(dòng)物
        3.2.6 肺泡巨噬細(xì)胞的分離鑒定
        3.2.7 PCV2感染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        3.2.8 肺泡巨噬細(xì)胞總RNA的提取
        3.2.9 樣品RNA熒光標(biāo)記
        3.2.10 芯片的雜交與清洗
        3.2.11 基因芯片掃描
        3.2.12 基因芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析
        3.2.13 芯片結(jié)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析
        3.2.14 細(xì)胞因子檢測
        3.2.15 差異表達(dá)基因的互作分析
        3.2.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 感染前仔豬的檢測
        3.3.2 PCV2感染后和qPCR和IFA檢測結(jié)果
        3.3.3 樣品RNA質(zhì)量檢測
        3.3.4 芯片雜交結(jié)果及差異表達(dá)基因GO聚類分析
        3.3.5 差異基因互作網(wǎng)絡(luò)分析
        3.3.6 芯片結(jié)果qPCR驗(yàn)證
        3.3.7 PCV2感染后細(xì)胞上清中細(xì)胞因子檢測
    3.4 討論
        3.4.1 CD74在PCV2感染中的作用
        3.4.2 Toll樣受體通路分析
        3.4.3 MHCII類分子與PCV2感染
        3.4.4 細(xì)胞凋亡和生長抑制
        3.4.5 鈣結(jié)合蛋白在PCV2感染中的作用
        3.4.6 炎癥反應(yīng)
    3.5 小結(jié)
第4章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 CHGDU毒株S基因核苷酸序列
    附錄2 CHGDU毒株S蛋白氨基酸序列
    附錄3 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP S基因的氨基酸序列
    附表1 PCV2感染后豬肺泡巨噬細(xì)胞差異表達(dá)的可注釋的基因
    附表2 差異表達(dá)基因生物學(xué)進(jìn)程(GO)分析
個(gè)人資料
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應(yīng)用及豬輪狀病毒的分離[D]. 張坤.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[4]豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03株分離鑒定[D]. 張桂紅.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3620696