利用原核表達(dá)載體pET-28a（+）構(gòu)建豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis, Mhr）的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）重組表達(dá)菌,研究GAPDH黏附宿主細(xì)胞的功能。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了表達(dá)rMhr-GAPDH的重組工程菌,利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),鎳柱親和層析純化,成功獲得高純度的rMhr-GAPDH重組蛋白。用重組蛋白免疫家兔制備多克隆抗體,對(duì)Mhr液體培養(yǎng)物和固體菌落進(jìn)行免疫雜交,均可檢測(cè)到GAPDH,提示其可表達(dá)于菌體表面。將rMhr-GAPDH蛋白與人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292共孵育,利用間接免疫熒光試驗(yàn)可檢測(cè)到黏附在細(xì)胞上的重組蛋白,利用微孔板黏附試驗(yàn)進(jìn)一步證明rMhr-GAPDH蛋白與細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合具有劑量依賴性,并可為其抗體所抑制。該研究構(gòu)建表達(dá)和純化了Mhr的GAPDH重組蛋白,檢測(cè)到其在菌體表面的表達(dá),并證明其具有黏附細(xì)胞能力,這有助于進(jìn)一步研究Mhr黏附感染的致病機(jī)制。 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2020,41(03)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pET-28a-rMhr-GAPDH的構(gòu)建（A）和rMhr-GAPDH重組蛋白表達(dá)純化（B)

利用制備的兔源GAPDH多抗，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)GAPDH在Mhr表面的表達(dá)，結(jié)果（圖2）顯示，在不破壞細(xì)胞膜的情況下加入抗rMhr-GAPDH陽(yáng)性血清孵育的Mhr有明顯的綠色熒光信號(hào)，而加入陰性血清孵育的Mhr無(wú)熒光信號(hào)；同時(shí)，通過(guò)菌落免疫雜交試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，在不破壞細(xì)胞膜的情況下高免兔血清抗體可與PVDF膜上的Mhr單菌落雜交出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性雜交點(diǎn)，而陰性血清無(wú)雜交反應(yīng)。結(jié)果提示GAPDH蛋白可表達(dá)在Mhr菌體表面。2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)rMhr-GAPDH的黏附細(xì)胞能力

向培養(yǎng)NCI-H292的細(xì)胞孔中加入rMhr-GAPDH蛋白共同孵育，用間接免疫熒光法檢測(cè)黏附情況，結(jié)果（圖4）顯示，rMhr-GAPDH蛋白組可明顯觀察到綠色熒光信號(hào)，而BSA蛋白對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明rMhr-GAPDH可黏附NCI-H292細(xì)胞。2.4 微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)rMhr-GAPDH與細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合能力

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Mycoplasma infections and different human carcinomas[J]. Su Huang; Ji You Li; Jan Wu; Lin Meng; Cheng Chao Shou Beijing Institute for Cancer Research, Peking University School of Oncology, Beijing 100034. ChinaSu Huang, received B. A from Jiangxi Medical College of China in 1994. Now she is a graduate student pursuing a Ph. D degree at the Peking University School of Oncology..  World Journal of Gastroenterology. 2001(02)



本文編號(hào)：3620685