Gp96是熱休克蛋白HSP90家族一員,具有多種免疫學(xué)效應(yīng),包括提高抗原呈遞、刺激抗原呈遞細(xì)胞（APCs）產(chǎn)生細(xì)胞因子、激發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）反應(yīng),以及免疫佐劑效應(yīng)。本論文主要研究豬Gp96N對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的B、T細(xì)胞表位合成肽疫苗、B細(xì)胞表位串聯(lián)亞單位疫苗以及豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）滅活疫苗的免疫佐劑效應(yīng)。首先建立了表達(dá)豬Gp96N的大腸桿菌和畢赤酵母p.pastoris-X33表達(dá)系統(tǒng),利用純化的豬Gp96N作為免疫佐劑,在小鼠和豬上,從細(xì)胞免疫、體液免疫和天然免疫角度,分析了豬Gp96N對(duì)上述三種疫苗的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。研究結(jié)果為豬Gp96N作為免疫佐劑在疫苗中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。從豬腎臟中提取RNA,采用RT-PCR擴(kuò)增得到豬Gp96N基因cDNA片段,分別插入載體pET-32a和pPICZαA中,構(gòu)建出原核表達(dá)載體pET-32a/Gp96N和真核表達(dá)載體pPICZaA/Gp96N,分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21和畢赤酵母p.pastoris-X33中,經(jīng)抗性篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET-32a/Gp96N和重組畢赤酵母p.p... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

大腸表達(dá)豬Gp96N的基因克�。ˋ)、SDS-PAGE(B)和Westerblot檢測(cè)結(jié)果（C)

3.2.1 PCR擴(kuò)増得到豬Gp96N基因以pET-32a/Gp96N為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1002bp左右的片段（圖2-2)，與預(yù)期相符，表明PCR擴(kuò)增得到豬Gp%N基M(bp) 130(%■靈免,交■？f^r?- ^圖2-2酵母菌表達(dá)豬Gp96N的基因克隆Fig.2-2 PCR product of Gp96N gene. M: DNA marker ； 1 :Gp96N gene3.2.2構(gòu)建得到畢赤酵姆表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA/Gp96N將PCR擴(kuò)增得到的豬Gp%N基閃片段勾載體pPICZaA用A7;o /和Xk//雙酶切，純化冋收酶切產(chǎn)物，WT4DNA連接酶反應(yīng)1211構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-Gp96N，轉(zhuǎn)化人腸桿歯DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組歯。挑取重組歯單克隆，提取質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-Gp%N經(jīng)/和/雙酶切后，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2-3所示

.15統(tǒng)計(jì)學(xué)分析釆用r檢驗(yàn)法比較各組之W的差異，/^>0.05代表差兄顯著；*尸<0.05代表差兄顯著；**尸<0.01表差兄非常顯著；***P<0.001代表差兄極顯著。結(jié)果與分析.1 PRRSV的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的序列分析選樣2條文獻(xiàn)報(bào)道的能被PRRSV中和抗體識(shí)別的B細(xì)胞表位Gp4-59B和Gp5-37B，以及7條RRSV的T細(xì)胞抗原表位（表3-1)。然后，從GeneBank t下載了大量II哨PRRSV毒株的GP4(379）、GP5 (1001條）和N蛋(226條）序列，利用Weblogo軟件對(duì)這些表位的氨基酸進(jìn)行保守性析，結(jié)果如圖3-1所示，除GP4-59B變兄性較大外，其他8條序列（GP5-37B、GP4-7T、GP4-170T、P5-149T、GP5-U7T、N-49T、N-63T和N-104T)均丨?分保守。利用DNAStar軟件分析表位的抗原發(fā)現(xiàn)GP5-37B、GP4-7T和GP4-170T的抗原性較差，其他6條表位的抗原性均較商（圖3-1)。因，報(bào)據(jù)保守性分析結(jié)果合成這些表位多肽。S % e T I N k I s (;p4-l70'^;< ■ ? * ? i ? t r i

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3564126