乳腺炎是影響奶牛生產(chǎn)的主要疾病之一。快速準確鑒定出引起奶牛乳腺炎發(fā)病的主要病原體,對奶牛乳腺炎的防治、患病牛只的隔離治療、凈化牛群以及保證牛群健康生產(chǎn)具有十分重要的意義。但在生產(chǎn)實踐中,受到儀器設備、人員水平和養(yǎng)殖區(qū)域等現(xiàn)實條件制約,現(xiàn)有奶牛乳腺炎檢測技術顯的相對滯后。常規(guī)培養(yǎng)基檢測病原的方法繁瑣費時,而且經(jīng)常出現(xiàn)假陽性結果。而利用PCR方法檢測某一病原體的方法對操作人員水平和設備要求較高、不便在一線養(yǎng)殖中全面推廣。因此,開發(fā)快速、特異、靈敏、便捷、經(jīng)濟適用的奶牛乳腺炎病原菌檢測方法具有重要的應用推廣價值和市場需求。環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一種新型等溫核酸擴增技術,因其檢測的特異性好、靈敏度高、耗時短、可操作性強等多種優(yōu)點,近些年該技術已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲等多種病原生物的檢測中,在人、畜等的病原物檢測及疾病的早期診斷等領域有著十分廣闊的應用前景。本研究通過技術優(yōu)化和方案改進,建立了基于LAMP檢測奶牛乳腺炎主要致病菌的方法。主要內(nèi)容包括:（1）結合鹽酸胍裂解液和核酸提取柱,建立了從牛奶中快速... 

【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

奶牛乳腺炎發(fā)展示意圖

進行鏈置換反應，實現(xiàn)恒定溫度條件下對目的 DNA 片段進行體外快速擴增。該技術關鍵點是引物設計，引物設計主要包括兩點：促使反應起始物的形成；擴增末端能夠形成獨特莖環(huán)結構以使反應能夠循環(huán)。LAMP 擴增反應包括三個過程:引物設計、反應起始物形成以及擴增的往復循環(huán)。LAMP 反應檢測的優(yōu)點有：（1）特異性強、靈敏度高。比PCR 擴增的靈敏度高出1~2 個數(shù)量級；（2）反應快速高效、反應條件簡單。不需要 PCR 的預變性步驟，核酸的擴增在水浴鍋中或恒溫箱恒溫條件下反應1h 左右就可以完成；（3）結果易于觀察。通過自然光下看渾濁度，直接觀察或高速離心后觀察是否有沉淀，也可加入不同的顯色劑來觀察顏色變化。3.2 LAMP 反應原理鏈置換型 DNA 聚合酶（如圖 2）：這種聚合酶（Bst DNAPolymerase）最適溫度是 65℃，在擴增雙鏈 DNA 時能對其中一條鏈邊解離邊伸長。

LAMP 的擴增分大致分為三個階段：1）循環(huán)模板合成階段由于雙鏈 DNA 模板在 60 ℃ ~65℃環(huán)境下處于不穩(wěn)定、動態(tài)的平衡狀態(tài)，此時在大片段鏈置換型 DNA 聚合酶( Bst DNApolymerase)的催化作用下，該反應體系的正向內(nèi)引物 FIP 外引物 F3 依次與各自位點特異性結合（如圖 3），形成兩條各自互補的 DNA 單鏈，新合成的 DNA 單鏈其中一端存在能與自身互補配對的堿基片段，這部分自配對生成帶有環(huán)狀結構的 DNA 單鏈。隨后反向內(nèi)引物 BIP 和外引物 B3 依次結合到各自匹配的特異性結合位點，并打開DNA 單鏈在上一步形成的環(huán)狀結構合成了兩端反向的環(huán)狀結構鏈。因此，當整條鏈呈現(xiàn)出啞鈴狀結構時，LAMP 擴增的起始階段完成了。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]南寧某牛場奶牛乳房炎調(diào)查及其快速檢測方法的建立與應用[D]. 鄒佳琪.廣西大學 2016
[2]奶牛鏈球菌性乳房炎可視化LAMP檢測方法的建立及應用[D]. 賀婷.廣西大學 2014



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